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(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510006)

崗梅來源于冬青科植物梅葉冬青(Ilexasprella(Hook. et Arn.) Champ. ex Benth.)的干燥根及莖[1]，主產(chǎn)于廣東、廣西、湖南、江西等地，具有清熱解毒、生津止渴、利咽消腫之功效，臨床上用于治療感冒發(fā)熱、肺熱咳嗽等疾病[2]。近些年來，市場上以崗梅為主要原料之一的三九感冒靈、外感風(fēng)痧顆粒、廣東涼茶等銷售量大漲，對原藥材的需求急劇上升，導(dǎo)致野生崗梅遭到大量采挖，造成其野生資源短缺，陷入中成藥生產(chǎn)及臨床應(yīng)用供不應(yīng)求的困境。因此，開展崗梅人工種植以保障市場供應(yīng)已勢在必行。

生產(chǎn)上崗梅主要以種子進(jìn)行繁殖。中藥材種子是中藥材生產(chǎn)和質(zhì)量控制的源頭，種子質(zhì)量的好壞決定了藥材產(chǎn)量的多寡及質(zhì)量的優(yōu)劣。目前，我國種子質(zhì)量檢測的主要內(nèi)容包括水分、凈度、千粒重、發(fā)芽率、純度和生活力，其中種子生活力水平的檢測是種子質(zhì)量檢測體系中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，因?yàn)榉N子生活力水平的高低不僅關(guān)系到種子的質(zhì)量，還影響到植物材料使用者的經(jīng)濟(jì)效益[3]。而種子生活力的檢測卻可以有效的避免這種情況的發(fā)生，因?yàn)榉N子生活力的變化先于種子發(fā)芽力的變化，種子生活力與種子的田間出苗率密切相關(guān)[4]。當(dāng)前國內(nèi)對崗梅的化學(xué)[5]和藥理[6]有大量報道，但是對崗梅的種子及種苗僅有少量研究[7-8]，故有必要進(jìn)一步探討崗梅種子生活力測定的最佳方法及條件，以客觀評價崗梅種子的質(zhì)量。本試驗(yàn)以石正、仁居、仁居苗圃3個產(chǎn)地的崗梅種子為材料，分別用四氮唑染色法(TTC法)、溴麝香草酚藍(lán)法(BTB法)和紅墨水染色法測定崗梅種子的生活力，從而優(yōu)化其生活力測定的方法及條件，并采用發(fā)芽率初步評價崗梅種子生活力測定方法的可靠性和準(zhǔn)確性，為后續(xù)研究和生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 種子材料

崗梅種子于2016年6月采收自廣東省平遠(yuǎn)縣仁居鎮(zhèn)、石正的崗梅種植基地和仁居苗圃，去除雜質(zhì)后于4 ℃低溫沙藏。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)詹若挺研究員鑒定為梅葉冬青(Ilexasprella(Hook. Et Arn.) Champ. ex Benth.)的種子。批號分別為仁居(GM 20160615-RJ)、仁居苗圃(GM 20160615-RJSY)和石正(GM 20160615-SZ)。

1.1.2 試 劑

十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、赤霉素(阿拉丁試劑有限公司)；紅四氮唑、溴麝香草酚藍(lán)(上海麥克林生化科技有限公司)；紅色墨水(上海精細(xì)文化用品有限公司)。

TTC溶液的配制：稱取1.819 3 g KH2PO4溶解于200 mL純水中，標(biāo)記為“溶液Ⅰ”，稱取7.1704 g Na2HPO4·12 H2O溶解于300 mL純水中，標(biāo)記為“溶液Ⅱ”，將溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合均勻即得磷酸緩沖液。再分別稱取0.1、0.5、1.0 g的紅四氮唑溶解于100 mL磷酸緩沖液中，即得到0.1%、0.5%和1.0%的TTC溶液。

0.1%BTB凝膠平板的制備：稱取0.5 g溴麝香草酚藍(lán)粉末和5 g瓊脂粉溶解于煮沸過的500 mL純水中，緩慢加熱并不斷攪拌，待瓊脂完全溶解后停止加熱，此時溶液顯黃色，加入數(shù)滴氨水，使之呈藍(lán)色為止，趁熱倒入9 cm的培養(yǎng)皿中，冷卻后用封口膜封口，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5%紅墨水染色液的配制：取5 mL紅墨水與95 mL純水混合均勻后即可。

1.2 方 法

1.2.1 生活力的測定

取低溫沙藏8個月的石正(GM 20160615-SZ)崗梅種子適量，洗去沙子、去除雜質(zhì)后用吸水紙盡量把水吸干，用于TTC法、BTB法和紅墨水染色法的生活力測定條件優(yōu)化。獲得3個測定方法的最適條件后，用于仁居(GM 20160615-RJ)和仁居苗圃(GM 20160615-RJSY)的崗梅種子的生活力測定。

1) TTC法。取GM 20160615-SZ崗梅種子隨機(jī)分為2組，清水浸種4 h后，其中1組用手術(shù)刀沿種胚中心線縱切為兩半，取帶種胚較完好的一半放入裝有四氮唑溶液的2 mL離心管中，采用L9(33)正交表對染色溫度、染色時間及TTC濃度3個條件進(jìn)行考察，見表1。染色結(jié)束后，倒去四氮唑溶液，純水沖洗3次后觀察。另1組崗梅種子沸水煮3 min后剖開， 于1%TTC中40 ℃避光染色9 h。觀察崗梅種子的染色情況，記錄有生活力種子的數(shù)量。每組含4個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子。判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)種子胚著色程度和對照組染色情況鑒定種子的生活力，種子的胚及胚乳染成紅色為有生活力的種子，反之則為無生活力的種子[9]。

表1 TTC染色法正交試驗(yàn)因素與水平

水平染色溫度(℃)TTC濃度(%)染色時間(h)1300.132350.563401.09

2) BTB法。取GM 20160615-SZ崗梅種子隨機(jī)分為2組，浸種12 h后，其中1組崗梅種子分別整齊地埋于備好的0.1%BTB凝膠平板中，種子面與凝膠面平行。將平板分別置于25，30，35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，于第18、20、22、24小時的時間點(diǎn)進(jìn)行觀察。另1組崗梅種子沸水煮3 min，按相同操作埋于0.1%BTB凝膠平板中，置35 ℃恒溫箱培養(yǎng)。觀察崗梅種子周圍的黃色暈圈情況，記錄有生活力種子的數(shù)量。每組4個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子。判定標(biāo)準(zhǔn)：種子周圍出現(xiàn)黃色暈圈為有生活力的種子，反之則為無生活力的種子[10-11]。

3) 紅墨水染色法。取GM 20160615-SZ崗梅種子隨機(jī)分為2組，浸種4 h后，其中1組用手術(shù)刀沿種胚中心線縱切為兩半，取帶種胚完好的一半放入盛有5%紅墨水溶液的2 mL離心管中，置于30 ℃恒溫箱中染色10，15，20 min。染色完成后，倒去紅墨水，純水沖洗3次后觀察。另1組崗梅種子沸水煮3 min，同樣操作并在5%紅墨水溶液中染色20 min。觀察崗梅種子的染色情況，記錄有生活力種子的數(shù)量。每組4個重復(fù)，每個重復(fù)30粒種子。判定標(biāo)準(zhǔn)：種子的胚及胚乳未染色者為有生活力的種子，反之則為無生活力的種子[10- 11]。

1.2.2 發(fā)芽試驗(yàn)

取去除沙子和雜質(zhì)的3批崗梅種子各200粒用于發(fā)芽試驗(yàn)。每個批次的200粒種子隨機(jī)分為4個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種，參照李俊仁等[7]優(yōu)化得到的最佳條件進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

有生活力種子的比率(%)=(有生活力的種子數(shù)/測試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/50)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 生活力的測定

2.1.1 TTC法

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，以石正的崗梅種子為材料，生活力測定的最佳條件為1%TTC濃度于35 ℃染色9 h。各因素中只有染色時間對崗梅種子生活力測定具有顯著影響(p<0.05)，而染色溫度和TTC濃度對其生活力測定影響較小，3個因素對崗梅種子生活力測定效果的影響大小順序?yàn)椋喝旧珪r間>染色溫度>TTC濃度(見表3)。用TTC法的最佳條件對石正、仁居和仁居苗圃的崗梅種子測定其生活力，分別為72.0%、69.2%、77.5%，單因素方差分析發(fā)現(xiàn)3個產(chǎn)地間的崗梅種子生活力沒有顯著性差異(p>0.05)。

2.1.2 BTB法

以石正的崗梅種子為材料，BTB法最佳的測定條件為35 ℃、培養(yǎng)22 h。其中，溫度對BTB法測定崗梅種子生活力的結(jié)果具有顯著影響(p<0.05)(見表5)。另外，當(dāng)在同一個溫度時，隨著時間的延長，種子的生活力逐漸加強(qiáng)，其中25 ℃和30 ℃在第24小時表現(xiàn)出相同的生活力水平，而35 ℃在最開始的第18小時就表現(xiàn)為較高的生活力，在第22小時就達(dá)到100%，說明溫度對BTB法測定崗梅種子生活力的結(jié)果影響較大(見表4)。再以BTB法的最佳條件對石正、仁居和仁居苗圃的3批崗梅種子進(jìn)行生活力測定，測定結(jié)果分別為100%、49%、97%，說明在用BTB法于35 ℃、共培養(yǎng)22 h時，石正產(chǎn)地的崗梅種子生活力測定值最好。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

因素染色溫度(℃)TTC濃度(%)染色時間(h)有生活力種子的比率(%)實(shí)驗(yàn)1401.0348.5實(shí)驗(yàn)2300.5963.5 實(shí)驗(yàn)3400.1970.5 實(shí)驗(yàn)4301.0627.0實(shí)驗(yàn)5351.09 72.0實(shí)驗(yàn)6400.5658.5實(shí)驗(yàn)7350.534.0實(shí)驗(yàn)8350.169.5實(shí)驗(yàn)9300.130.0 均值130.226.717.5均值228.54232.7均值359.249.268.7極差2922.551.2

表3 單因素方差分析結(jié)果

源Ⅲ型平方和df均方FSig.校正模型6764.667a61127.44415.3510.062截距13884.694113884.694189.0500.005染色溫度1784.2222892.11112.1470.076TTC濃度792.7222396.3615.3970.156染色時間4187.72222093.86128.5090.034誤差146.889273.444總計20796.2509校正的總計6911.5568

表4 BTB法測定結(jié)果(陽性率/%)

培養(yǎng)溫度(℃)培養(yǎng)時間(h)18202224 250.5±0.529.5±9.564.0±19.668.5±16.5300.0±0.02.5±2.533.0±7.567.0±5.43593.0±5.097.0±3.0100.0±0.0100.0±0.0

表5 單因素方差分析結(jié)果

源Ⅲ型平方和df均方FSig.校正模型15633.125a53126.6259.7920.008截距35752.083135752.083111.9710.000溫度11501.04225750.52118.0100.003時間4132.08331377.3614.3140.061誤差1915.7926319.299總計53301.00012校正的總計17548.91711

2.1.3 紅墨水法

同樣以石正的崗梅種子為試驗(yàn)材料，紅墨水法的最佳測定條件為5%紅墨水溶液于30 ℃染色20 min。紅墨水法染色時間對崗梅種子的生活力測定沒有顯著差異(p>0.05)。再用紅墨水法的最佳條件分別對石正、仁居和仁居苗圃的崗梅種子進(jìn)行生活力測定，測定結(jié)果分別為98.3%、95%、94.2%，各產(chǎn)地間的生活力水平?jīng)]有顯著差異(p>0.05)。

表6 紅墨水法測定結(jié)果

時間(min)有生活力種子的比率(%)1095.8±5.01597.5±5.02098.3±3.3

2.2 發(fā)芽試驗(yàn)

發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果表明，石正、仁居和仁居苗圃的發(fā)芽率分別為21%、13.5%、13%，各產(chǎn)地間的發(fā)芽率沒有顯著差異(p>0.05)。

表7 崗梅種子發(fā)芽結(jié)果

產(chǎn)地發(fā)芽率(%)石正21.0±3.8仁居13.5±4.4仁居苗圃13.0±3.5

3 討 論

TTC法測定種子生活力水平的主要依據(jù)是有生活力種子的胚乳含有脫氫酶，具有脫氫還原作用，而無色的紅四氮唑溶液能與活細(xì)胞內(nèi)的三羧酸代謝途徑中釋放出來的氫離子結(jié)合，產(chǎn)生一種紅色、穩(wěn)定、不會擴(kuò)散和不溶于水的三苯基甲替，能夠有效地區(qū)分紅色的有生活力部分和無色的死亡組織[12]。而BTB法測定生活力的原理是種子的活組織能進(jìn)行呼吸作用釋放出CO2，CO2溶于水中生成H2CO3，可釋放出H+和HCO3-，使種子周圍呈酸性，而本試驗(yàn)所配置的0.1%BTB溶液是經(jīng)過加堿調(diào)整顯藍(lán)色，遇酸性溶液后會顯示為黃色，從而可以直觀地根據(jù)顏色的變化來區(qū)別有生活力的種子和死亡的種子[10-11]。另外，紅墨水法測定崗梅種子生活力時，由于崗梅種子的種皮較硬，浸種4 h后，縱切時還是會對切口處的種子細(xì)胞造成損傷，容易被染成粉紅色，造成誤判，且其不能區(qū)分不同產(chǎn)地的崗梅種子生活力的情況，故紅墨水染色法不適合用來測定崗梅種子的生活力。此外，將本試驗(yàn)優(yōu)化得到的TTC法和BTB法測定的最佳條件相比，TTC法較BTB法的操作簡便，縮短了浸種時間和染色時間，節(jié)省試劑用量，且比李俊仁等[7]的TTC法測定生活力的條件縮短了染色時間，降低了染色溫度，故本研究優(yōu)化的TTC法是崗梅種子生活力測定的更優(yōu)方法。

本試驗(yàn)測定了石正、仁居和仁居苗圃3個來源的崗梅種子的生活力和發(fā)芽率，發(fā)現(xiàn)仁居苗圃產(chǎn)地的崗梅種子在3個測定方法中均表現(xiàn)出較高的生活力，但其發(fā)芽率只有13%；而石正產(chǎn)地的崗梅種子用TTC法測定其生活力為72%，其發(fā)芽率為21.0%，均表現(xiàn)出較高的測定結(jié)果，說明該產(chǎn)地的崗梅種子質(zhì)量優(yōu)于另外2個來源，可以用于生產(chǎn)崗梅種子苗。但是，3個產(chǎn)地的崗梅種子生活力的測定結(jié)果都遠(yuǎn)高于其發(fā)芽率測定結(jié)果，可能與其存在生理休眠有關(guān)，提高發(fā)芽率及田間出苗率的方法仍需進(jìn)一步研究。