周一鵬， 何 麗， 羅 麗， 許曉玲， 徐小勇

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

原生質(zhì)體指采用酶解法或機(jī)械法去掉細(xì)胞壁的裸露活細(xì)胞，在一定條件下可以發(fā)育成完整的植株，同時，原生質(zhì)體也是一種理想的單細(xì)胞系統(tǒng)[1]。因此，原生質(zhì)體可以為現(xiàn)代生物技術(shù)研究的諸多方面提供有利的試驗(yàn)材料，已被廣泛地應(yīng)用于植物基礎(chǔ)理論研究和遺傳改良中[2-3]。然而，原生質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用的首要前提是分離出高質(zhì)量的原生質(zhì)體。由目前的研究現(xiàn)狀可知，影響原生質(zhì)體分離的因素主要有分離起始材料、預(yù)處理、酶液組合和濃度、酶解時間、滲透壓等。其中，酶液組合是影響原生質(zhì)體分離成敗的關(guān)鍵因素之一[4-5]。

目前，人們廣泛使用的酶液組合為纖維素酶+離析酶或纖維素酶+果膠酶，已被成功地用于小麥、馬鈴薯、油菜、柑橘等植物的原生質(zhì)體分離[6]。另外，值得注意的是，不同來源的纖維素酶對原生質(zhì)體分離也有影響。研究發(fā)現(xiàn)，相對于非純化的纖維素酶，純化的纖維素酶用于煙草和葡萄原生質(zhì)體分離時，可降低活性氧水平，提高分離效果[7-8]。柑橘原生質(zhì)體主要由愈傷組織和葉片分離而來，所使用的酶液組合皆為纖維素酶R-10+離析酶R-10，然而纖維素酶R-10是一種非純化的纖維素酶。本研究擬采用純化的纖維素酶Worthington+離析酶R-10的酶液組合與常規(guī)酶液組合進(jìn)行椪柑原生質(zhì)體的分離，比較它們在原生質(zhì)體酶解時間、產(chǎn)量及活性氧含量上的差異，從而分析纖維素酶純化與否對椪柑原生質(zhì)體分離的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將椪柑(CitrusreticulataBlanco)胚性愈傷組織保存于MT基本培養(yǎng)基中，每20 d繼代1次；將愈傷組織用懸浮培養(yǎng)基(MT+0.5 mg/L ME+1.5 mg/L谷胺酰氨+50 g/L蔗糖)懸浮培養(yǎng)4代后用于原生質(zhì)體的分離。

取新鮮椪柑果實(shí)，去掉果肉，將種子用水沖洗干凈，用 1 mol/L NaOH浸泡10min，去掉果膠，轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)，用無菌蒸餾水沖洗后，再用75%乙醇浸泡10 min，然后用1% NaClO溶液消毒20 min，再然后用無菌蒸餾水沖洗3次，每次5 min。最后用滅過菌的手術(shù)刀片剝?nèi)?nèi)外種皮，接種到MT培養(yǎng)基上，大約過30～40 d，待葉片充分展開后用于原生質(zhì)體分離。

1.2 主要試劑

主要試劑有蔗糖、甘露醇、瓊脂粉、嗎啉乙磺酸(MES)、纖維素酶(R-10 Onozuka，Yakult Honsha，Tokyo)、纖維素酶(Worthington Biochemical Corporation)、離析酶(R-10 Onozuka，Yakult Honsha，Tokyo)、麥芽提取物、NaH2PO4、CaC12·2H2O、CPW13(含13%甘露醇的細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液)、CPW26(含26%蔗糖的細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液)、活性氧檢測試劑盒。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 椪柑原生質(zhì)體的分離 原生質(zhì)體的分離參照何麗等的方法[9-10]，稍作修改。

愈傷組織原生質(zhì)體的分離。取3 g愈傷組織于培養(yǎng)皿中，加入2 mL 0.7 mol/L EME培養(yǎng)基(MT+0.7 mol/L蔗 糖+0.5 g/L ME)中，再加入2 mL酶液(含2%纖維素酶R-10或纖維素酶Worthington+2%離析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaC12·2H2O，pH值為5.8)。將培養(yǎng)皿用封口膜封口，于28 ℃暗條件下酶解24 h，酶解過程中每隔一段時間觀察原生質(zhì)體的分離情況，以確定最佳酶解時間。

葉肉原生質(zhì)體的分離。取出試管苗的葉片，置于鋪有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀片將葉片切成1～2 mm寬的條狀，之后放入預(yù)先加了2 mL左右0.6 mol/L EME(配方為 MT+0.6 mol/L蔗糖+0.5 g/L ME)的培養(yǎng)基中，最后加入 2 mL 酶液(含2%纖維素酶R-10或纖維素酶Worthington+2%離析酶R-10+10.9%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaC12·2H2O，pH值為5.8)。將培養(yǎng)皿用封口膜封口，于28 ℃黑暗條件下酶解24 h，其間每隔一段時間觀察原生質(zhì)體分離情況。

將酶解完成后的原生質(zhì)體(酶解混合物)通過孔徑為 45 μm 的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，并用CPW13沖洗，之后將濾液轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，于950 r/min離心10 min，去上清。將原生質(zhì)體沉淀與2 mL CPW13混勻，之后用吸管輕輕轉(zhuǎn)移到預(yù)先加入6 mL CPW26的離心管中，于930 r/min離心2 min，經(jīng)CPW13/CPW26界面梯度離心純化后，用吸管將2個液面間的原生質(zhì)體帶吸出。將純化后的原生質(zhì)體懸浮于電融合液(含12.7%甘露醇+0.03% CaC12)中備用。

1.3.2 椪柑原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定 采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定。先將蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)室上，將原生質(zhì)體懸浮液滴在蓋玻片一側(cè)邊緣，使其沿著蓋玻片和計(jì)數(shù)板間的縫隙滲入計(jì)數(shù)室，直到充滿計(jì)數(shù)室為止。依次逐個計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)25個中方格里的原生質(zhì)體數(shù)，然后根據(jù)下式計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量：

1 mL懸浮液中的原生質(zhì)體數(shù)=1個大方格懸浮液中的原生質(zhì)體數(shù)×104；

原生質(zhì)體產(chǎn)量(個/g)=原生質(zhì)體密度(個/mL)×原生質(zhì)體懸浮液的總體積(mL)/葉片質(zhì)量(g)。

1.3.3 椪柑原生質(zhì)體中活性氧含量的測定 采用活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測定原生質(zhì)體中的活性氧含量。按照1 ∶1 000的比例，用原生質(zhì)體培養(yǎng)液稀釋2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，使其終濃度為10 μmol/L。將原生質(zhì)體收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，使原生質(zhì)體濃度為106～107mL，于37 ℃水浴鍋內(nèi)孵育 20 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次，使探針和原生質(zhì)體充分接觸。之后，用原生質(zhì)體培養(yǎng)液將處理好的原生質(zhì)體洗滌3次，以充分除去未進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi)的DCFH-DA。最后設(shè)置1個對照管，按照體積比1 ∶1 000的比例加入陽性對照Rosup，并設(shè)置1個未加DCFH-DA的陰性對照。做好前處理后，于 30 min 內(nèi)上樣，用FACSAria流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel 2003計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SPSS進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶液組合對原生質(zhì)體酶解時間的影響

對于不同的酶液組合或酶解材料，其酶解時間一般也不同，因此在酶解過程中要進(jìn)行持續(xù)觀察，當(dāng)觀察到原生質(zhì)體數(shù)量不再增多時，可停止酶解，開始后續(xù)試驗(yàn)，該階段時間可視為適宜的酶解時間。本研究首先觀察了酶液組合Ⅰ(纖維素酶R-10+離析酶R-10)和酶液組合Ⅱ(纖維素酶Worthington+離析酶R-10)對2種外植體酶解時間的影響。結(jié)果表明，對于愈傷組織或葉片，2種酶液組合所需的酶解時間均存在差異(圖1)。總體而言，酶液組合Ⅰ所需的酶解時間較長，分別為18 h(愈傷組織)、20 h(葉片)；酶液組合Ⅱ所需的酶解時間則分別為6 h(愈傷組織)、16 h(葉片)。上述結(jié)果表明，采用純化纖維素酶的酶液組合可以縮短酶解時間，從而提高原生質(zhì)體的分離效率。

2.2 不同酶液組合對椪柑原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

原生質(zhì)體產(chǎn)量是衡量原生質(zhì)體分離效果的重要指標(biāo)。因此，本研究測定了2種酶液組合條件下原生質(zhì)體的產(chǎn)量。如圖2所示，酶液組合Ⅱ所獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量均比酶液組合Ⅰ高，且差異顯著。酶液組合Ⅱ處理的愈傷組織原生質(zhì)體的產(chǎn)量為酶液組合Ⅰ的9.09倍，酶液組合Ⅱ處理的葉肉原生質(zhì)體產(chǎn)量為酶液組合Ⅰ的5.29倍。由此可見，酶液組合Ⅱ能較大地提高原生質(zhì)體產(chǎn)量，從而為后續(xù)的原生質(zhì)體操作，如細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)化或分子生物學(xué)研究提供了量的保證。

2.3 不同酶液組合對椪柑原生質(zhì)體活性氧水平的影響

水稻、油菜、煙草和葡萄等植物的原生質(zhì)體在分離過程中會產(chǎn)生活性氧[7，11-13]，而過多的活性氧積累會影響原生質(zhì)體的再生。此外有研究表明，纖維素酶的純度會影響原生質(zhì)體的活性氧水平[7]。因此，本研究采用活性氧檢測試劑盒測定了2種酶液組合條件下剛分離時原生質(zhì)體的活性氧水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶液組合Ⅰ中的愈傷組織原生質(zhì)體的活性氧水平是酶液組合Ⅱ的1.96倍，且差異顯著；對于葉肉原生質(zhì)體，2種酶液組合間差異不顯著(圖3)。

3 結(jié)論與討論

植物原生質(zhì)體的分離涉及到細(xì)胞壁的去除，而這個過程需要借助一些酶制劑來完成。常用的酶制劑主要有纖維素酶、半纖維素酶、離析酶、果膠酶等。其中，纖維素酶可以降解細(xì)胞壁的主要成分纖維素，其純度和活力的高低直接影響原生質(zhì)體的分離效果。本研究比較了酶液組合Ⅰ(纖維素酶 R-10+離析酶R-10)和酶液組合Ⅱ(纖維素酶Worthington+離析酶R-10)對椪柑原生質(zhì)體分離的影響。結(jié)果表明，酶液組合Ⅱ在原生質(zhì)體酶解時間和產(chǎn)量方面均明顯優(yōu)于酶液組合Ⅰ。因此可見，酶液組合Ⅱ更適合椪柑原生質(zhì)體的分離。

對于這2種酶液組合在分離原生質(zhì)體上的差異，可能有以下2個原因：一是酶液組合中的2種纖維素酶在酶活性上存在差異。纖維素酶R-10又稱1，4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，來源于綠色木霉，含有降解天然纖維素的活性，1 mg酶制劑含有10 U酶活性單位；纖維素酶Worthington來源于里氏木霉，具有外切、內(nèi)切葡聚糖酶活性，能夠有效水解纖維素，1 mg酶制劑含有140 U酶活性單位。在同等濃度的條件下，纖維素酶Worthington降解細(xì)胞壁纖維素的速度更快，所需的酶解時間也就越短。二是2種纖維素酶在純度上存在差異。纖維素酶Worthington是通過色析法純化而來的，在純度上遠(yuǎn)高于纖維素酶R-10。已有研究表明，非純化的酶在原生質(zhì)體酶解時易引起細(xì)胞損傷，而純化的纖維素酶能減少活性氧含量，有助于原生質(zhì)體的分離[7，11]，本研究也得到相似的研究結(jié)果?？傮w可以看出，純化的纖維素酶Worthington可高效地分離椪柑原生質(zhì)體，對于其他植物原生質(zhì)體的分離具有重要的參考價值。