汪書(shū)麗，羅 建，孫鳳榮，吉哈利

(1 西藏農(nóng)牧學(xué)院 高原生態(tài)研究所，西藏林芝 860000；2 西藏高原森林生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏林芝 860000；3 西藏林芝高山森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站，西藏林芝 860000；4 西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000)

喜馬拉雅紫茉莉[Mirabilishimalaica(Edgew.) Heimerl]屬于紫茉莉科(Nyctaginaceae)紫茉莉?qū)?MirabilisL.)植物[1]。它和變種中華紫茉莉(M.himalaicavar.chinensisHeimerl)是藏藥“喜馬拉雅紫茉莉”(巴朱)的正品原植物[2]。以干燥根入藥，被稱為傳統(tǒng)藏藥的“五根”之一，主要出現(xiàn)在具有滋補(bǔ)作用的藏成藥配方中，是西藏的Ⅰ級(jí)瀕危藏藥材之一[3]。作為一種重要的藏藥材，關(guān)于其研究多數(shù)集中在化學(xué)成分和藥理[4]等方面，而關(guān)于其果實(shí)方面的研究較少，主要在組織培養(yǎng)[5]、化感作用[6]、瘦果粘液[7]、萌發(fā)特性[3]等方面。關(guān)于喜馬拉雅紫茉莉的果實(shí)形態(tài)，唐昌林[8]將紫茉莉科果實(shí)類型描述為瘦果狀摻花果，而盧驍?shù)萚7]描述為瘦果。蘭小中等[3]對(duì)西藏芒康縣、朗縣、尼木縣、桑日縣的喜馬拉雅紫茉莉種子(摻花果)的質(zhì)量和萌發(fā)特性進(jìn)行了研究，并對(duì)4個(gè)縣的種子(摻花果)測(cè)量了長(zhǎng)、寬和千粒重，并進(jìn)行了簡(jiǎn)單形態(tài)描述。然而，較廣泛地對(duì)西藏喜馬拉雅紫茉莉居群展開(kāi)較全面的果實(shí)形態(tài)變異方面的分析還未見(jiàn)報(bào)道。掌握果實(shí)表型變異規(guī)律，是進(jìn)行果實(shí)鑒別、種源區(qū)劃等工作的前提和基礎(chǔ)，為種源試驗(yàn)采樣和試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供重要依據(jù)，同時(shí)也是遺傳育種的基礎(chǔ)[9]。本研究對(duì)西藏喜馬拉雅紫茉莉(包括其變種)16個(gè)種源的野生種質(zhì)資源的果實(shí)表型變異進(jìn)行廣泛的采樣和分析，討論其種源間的果實(shí)形態(tài)差異，為進(jìn)一步研究其遺傳多樣性和種質(zhì)選育等提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 野外調(diào)查

該研究于2014～2015年9～11月進(jìn)行，分別對(duì)對(duì)西藏4個(gè)市、12個(gè)縣、16個(gè)不同分布地點(diǎn)的喜馬拉雅紫茉莉居群進(jìn)行野外調(diào)查和取樣，各居群的地理位置信息見(jiàn)表1。

1.2 性狀測(cè)量

每個(gè)居群選取20～25個(gè)植株(TNC1，TNC2分別取12和15個(gè)植株)，16個(gè)居群共計(jì)選取351個(gè)植株(表1)。每個(gè)植株隨機(jī)選取3個(gè)果實(shí)，野外用游標(biāo)卡尺測(cè)量其總苞筒長(zhǎng)、總苞裂片寬和總苞裂片長(zhǎng)，精度為0.01 mm。之后采集其果實(shí)裝入信封并編號(hào)帶回實(shí)驗(yàn)室。

室內(nèi)處理干凈每個(gè)植株的所有果實(shí)，去掉總苞。每個(gè)植株隨機(jī)選取3粒健康摻花果，測(cè)量其長(zhǎng)和寬，摻花果的形狀用果長(zhǎng)/果寬[10]表示；摻花果的形態(tài)由Nikon SMZ18體式顯微鏡拍攝，放大10倍；放大鏡下觀察果實(shí)紋路，表面無(wú)明顯棱，具明顯凸凹不平的嵴[3]的摻花果，賦值為1，表面有很明顯的棱[7]的摻花果，賦值為2。由于喜馬拉雅紫茉莉摻花果被蟲(chóng)子啃食非常嚴(yán)重，每個(gè)植株選取1 000粒稱重非常困難，因此果實(shí)的重量選取百粒重指標(biāo)計(jì)量，每個(gè)植株選取100粒摻花果，用電子天平稱量，精確到0.01 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究共選取 8個(gè)果實(shí)性狀(表 2)。每個(gè)植株除百粒重外，其他7個(gè)性狀均取3個(gè)果實(shí)的平均值代表植株的各個(gè)性狀。同一個(gè)居群的所有單株果實(shí)性狀的平均值代表居群性狀；不同居群和總體果實(shí)性狀的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差用Excel 2010統(tǒng)計(jì)，變異系數(shù)(variation coefficient)用標(biāo)準(zhǔn)差/平均值表示[12]；單因素方差分析、主成分分析、聚類分析和相關(guān)性分析均用SPSS19.0進(jìn)行。其中，果實(shí)性狀指標(biāo)在居群間形態(tài)差異程度采用單因素方差分析(One way ANOVA)進(jìn)行測(cè)定；主成分分析(PCA)用以確定造成居群間表型變異的主要性狀；聚類分析采用離差平方和法(Ward)，基于8個(gè)性狀對(duì)16個(gè)居群進(jìn)行聚類；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性系數(shù)分析各性狀之間、各性狀和地理因子之間的相關(guān)性。

表1 喜馬拉雅紫茉莉居群采集地點(diǎn)概況

注：*標(biāo)注地點(diǎn)的經(jīng)緯度和海拔在吉哈利[11]中引用過(guò)，此處對(duì)經(jīng)緯度進(jìn)行轉(zhuǎn)換，并更正了個(gè)別數(shù)據(jù)

Notes: Locations marked with “*” have been cited in Ji[11]. Longitude and latitude data are transformed, and a few environmental data are corrected

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源喜馬拉雅紫茉莉的果實(shí)性狀

喜馬拉雅紫茉莉16個(gè)居群主要的果實(shí)性狀特征祥見(jiàn)圖1和表2。由表2可以看出，8個(gè)果實(shí)性狀的平均值在不同居群存在差異：八宿怒江山TNC2居群的總苞筒長(zhǎng)、總苞裂片長(zhǎng)和寬、果長(zhǎng)、果形、百粒重均最小。雖然其果寬為(2.41±0.14)mm，稍大于最小值LMS的(2.37±0.16)mm，但綜合其果長(zhǎng)和果寬，其摻花果仍然最小；其他居群未在各個(gè)性狀上表現(xiàn)出規(guī)律性：AP居群的總苞筒長(zhǎng)最大、果形長(zhǎng)寬比例最大。DJ居群的總苞裂片長(zhǎng)和寬均最大。SDG居群的果長(zhǎng)、果寬和百粒重最大；從果實(shí)紋路上看，各個(gè)居群均具有兩種類型的摻花果，只是2種類型的果實(shí)比例稍有差異。TNC1居群值最大(1.92 ± 0.21)，說(shuō)明B型摻花果多于A型。ZYZ居群值最小(1.07 ± 0.17)，說(shuō)明A型摻花果多于B型。

各居群的不同性狀的變異系數(shù)變化也存在差異：9個(gè)居群均以質(zhì)量性狀果紋路的變異系數(shù)最大，少數(shù)居群以百粒重或總苞裂片寬變異最大；除了LD居群的總苞筒長(zhǎng)變異最小，多數(shù)居群以果寬或果長(zhǎng)變異最小。將351個(gè)植株做為一個(gè)整體計(jì)算，總體上看，各性狀的變異系數(shù)在8.58%～25.57%之間，總苞裂片寬變異最大，而果寬變異最小。

各個(gè)性狀的單因素方差分析F值在12.180～134.761之間，均表現(xiàn)為極顯著，說(shuō)明各性狀在不同居群間存在明顯差異。8個(gè)形態(tài)指標(biāo)在居群間的差異程度依次為：總苞筒長(zhǎng)>總苞裂片寬>總苞裂片長(zhǎng)>果長(zhǎng)>果寬>百粒重>果紋路>果形。

2.2 主成分分析

按照最小特征根大于1.0的原則提取3個(gè)主成分(表3,4)，其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)81.683%，所以這3個(gè)主成分可以代替原始因子所代表的全部信息。第1主成分的特征值貢獻(xiàn)率為48.376%，對(duì)其作用最大的性狀主要為果長(zhǎng)(0.834)，其次為總苞裂片長(zhǎng)(0.828)和總苞裂片寬(0.816)；第2主成分特征值貢獻(xiàn)率為20.091%，對(duì)其作用最大的性狀主要為果形(0.865)；第3主成分特征值貢獻(xiàn)率為13.216%，對(duì)其作用最大的性狀主要為果紋路(0.432)。以上分析可以得知，貢獻(xiàn)率最大的第1主成分中的果長(zhǎng)、總苞裂片長(zhǎng)和總苞裂片寬的負(fù)荷均大于80%，說(shuō)明果長(zhǎng)和總苞裂片大小是造成各居群果實(shí)表型差異的主要因素。

居群代碼同表1圖1 不同居群喜馬拉雅紫茉莉的果實(shí)形態(tài)Code of population same as Table 1Fig.1 Morphological characteristics in different populations of M.himalaica

居群代碼Code of populationITL/mmILW/mmILL/mmFL/mmFW/mmFSFPFEW/gDX4.89±0.33(6.75)2.94±0.34(11.56)3.19±0.33(10.34)4.26±0.31(7.28)2.56±0.15(5.86)1.67±0.15(8.98)1.62±0.43(26.54)1.53±0.30(19.61)PG5.55±0.43(7.75)3.71±0.43(11.59)3.85±0.53(13.77)4.47±0.54(12.08)2.82±0.19(6.74)1.59±0.12(7.55)1.52±0.45(29.61)1.96±0.38(19.39)LD4.79±0.34(7.10)2.69±0.25(9.29)2.82±0.22(7.80)4.04±0.34(8.42)2.41±0.20(8.30)1.68±0.13(7.74)1.87±0.22(11.76)1.55±0.37(23.87)AP8.71±0.76(8.73)3.84±0.53(13.80)4.57±0.62(13.57)4.82±0.38(7.88)2.60±0.18(6.92)1.87±0.15(8.02)1.15±0.22(19.13)1.79±0.29(16.20)DJ6.00±0.38(6.33)4.50±0.30(6.67)4.68±0.36(7.69)4.82±0.25(5.19)2.84±0.16(5.63)1.72±0.12(6.98)1.38±0.25(18.12)2.02±0.26(12.87)NM8.56±0.65(7.59)3.85±0.30(7.79)4.43±0.36(8.13)4.86±0.26(5.35)2.80±0.23(8.21)1.75±0.17(9.71)1.47±0.29(19.73)1.76±0.60(34.09)DMC4.92±0.52(10.57)2.84±0.39(13.73)3.39±0.36(10.62)4.38±0.40(9.13)2.72±0.18(6.62)1.62±0.19(11.73)1.39±0.34(24.46)1.78±0.22(12.36)DBC5.20±0.64(12.31)2.85±0.40(14.04)3.63±0.50(13.77)4.51±0.24(5.32)2.77±0.16(5.78)1.64±0.11(6.71)1.39±0.27(19.42)1.97±0.17(8.63)TNC14.23±0.66(15.60)2.24±0.39(17.41)3.19±0.56(17.55)4.39±0.30(6.83)2.57±0.19(7.39)1.72±0.17(9.88)1.92±0.21(10.94)1.65±0.31(18.79)TNC23.84±0.59(15.36)1.76±0.31(17.61)2.63±0.35(13.31)3.66±0.29(7.92)2.41±0.14(5.81)1.52±0.11(7.24)1.78±0.24(13.48)1.25±0.16(12.80)YRC5.15±0.43(8.35)2.38±0.33(13.87)3.33±0.37(11.11)4.64±0.30(6.47)2.66±0.22(8.27)1.76±0.15(8.52)1.56±0.27(17.31)1.94±0.22(11.34)ZYZ4.99±0.61(12.22)2.78±0.80(28.78)2.96±0.40(13.51)4.88±0.29(5.94)2.76±0.18(6.52)1.78±0.12(6.74)1.07±0.17(15.89)2.09±0.29(13.88)SDG6.03±0.46(7.63)3.73±0.34(9.12)4.21±0.47(11.16)5.05±0.30(5.94)2.95±0.12(4.07)1.72±0.09(5.23)1.29±0.20(15.50)2.15±0.24(11.16)ZDZ5.18±0.49(9.46)3.22±0.39(12.11)3.68±0.49(13.32)4.18±0.25(5.98)2.73±0.13(4.76)1.53±0.09(5.88)1.25±0.15(12.00)1.69±0.16(9.47)LMS4.55±0.46(10.11)2.40±0.27(11.25)3.04±0.34(11.18)4.24±0.19(4.48)2.37±0.16(6.75)1.80±0.13(7.22)1.64±0.27(16.46)1.63±0.21(12.88)MZL5.02±0.61(12.15)2.51±0.25(9.96)3.05±0.33(10.82)4.33±0.21(4.85)2.77±0.11(3.97)1.57±0.08(5.10)1.42±0.15(10.56)1.88±0.14(7.45)總體Total5.52±1.38(25.00)3.05±0.78(25.57)3.56±0.74(20.79)4.49±0.46(10.24)2.68±0.23(8.58)1.69±0.16(9.47)1.46±0.35(23.97)1.79±0.37(20.67)F134.761??65.084??48.588??27.547??21.291??12.180??15.596??16.605??

注：ITL.總苞筒長(zhǎng)；ILW.總苞裂片寬；ILL.總苞裂片長(zhǎng)；FL.果長(zhǎng)；FW.果寬；FS.果形；FP.果紋路；FEW.百粒重。下同；括號(hào)內(nèi)為變異系數(shù)/%；**表示 a=0.01水平上差異極顯著

Note: ITL. Involucre tube length; ILW. Involucre lobe width; ILL. Involucre lobe length; FL. Fruit length; FW. Fruit width; FS. Fruit shape; FP. Fruit pattern. FEW.100 fruits weight. The same as below; The number in the bracket is the variation coefficient. **represent significance at the level of a=0.01

2.3 居群聚類分析

依據(jù)8個(gè)果實(shí)性狀對(duì)喜馬拉雅紫茉莉16個(gè)居群進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖2所示，在平方歐氏距離10的水平上，16個(gè)居群分為兩大支：分支1包括11個(gè)居群，表現(xiàn)為總苞筒較短(3.84～5.20 mm)、總苞裂片較小(寬1.76～3.22 mm、長(zhǎng)2.63～3.68 mm)。

表3 喜馬拉雅紫茉莉果實(shí)性狀相關(guān)矩陣的特征值、貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率

表4 喜馬拉雅紫茉莉8個(gè)果實(shí)性狀的主成分負(fù)荷量

分支2包括AP、NM、PG、SDG和DJ共5個(gè)居群，表現(xiàn)為總苞筒較長(zhǎng)(5.55～8.71 mm)、總苞裂片較大(寬3.71～4.50 mm、長(zhǎng)3.85～4.68 mm)。聚類分析的結(jié)果與各居群的地域分布并無(wú)直接關(guān)聯(lián)，兩個(gè)分支分布區(qū)域有交叉：分支1各居群分布在西藏的東部和東南部，而分支2的各居群分布在東南部。

2.4 相關(guān)性分析

由表5看出：8個(gè)果實(shí)性狀兩兩之間Pearson相關(guān)性的28個(gè)組合中，15個(gè)組合有極顯著的相關(guān)性，4個(gè)有顯著的相關(guān)性，說(shuō)明果實(shí)性狀之間在生長(zhǎng)發(fā)育上是相互影響的。其中，受較多性狀顯著影響的主要有3個(gè)性狀：果長(zhǎng)與其他7個(gè)性狀均存在極顯著的相關(guān)性，總苞裂片長(zhǎng)和總苞裂片寬均與除了果形外的其他6個(gè)性狀存在顯著或極顯著的相關(guān)性；與果形存在顯著相關(guān)性的性狀最少，僅總苞筒長(zhǎng)和果長(zhǎng)與其存在極顯著的正相關(guān)；果紋路和其他7個(gè)性狀均表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，其中和總苞裂片寬、總苞裂片長(zhǎng)、果長(zhǎng)和百粒重均達(dá)到顯著或極顯著水平。

圖2 喜馬拉雅紫茉莉果實(shí)形態(tài)聚類圖Fig.2 The clustering dendrogram of fruit traits of M. himalaica with squared Euclidean distance

指標(biāo)IndexITLILWILLFLFWFSFPFEWITL1ILW0.736??1ILL0.823?? 0.922??1FL0.653?? 0.685?? 0.720??1FW0.389 0.648?? 0.628??0.726??1FS0.511??0.2770.353 0.639??-0.0621FP-0.496 -0.536? -0.508?-0.642??-0.647-0.208 1FEW0.315 0.545? 0.512? 0.848??0.832??0.313-0.665??1海拔Altitude0.251 0.3230.3290.4370.3050.327-0.228 0.436經(jīng)度Longitude-0.483-0.591? -0.489 -0.177 -0.185-0.0590.101-0.046緯度Latitude0.032-0.227 0.0380.095 0.0310.0940.0670.025

注: **相關(guān)性極顯著(P<0.01); *相關(guān)性顯著 (P<0.05)

Note: **correlation is significant at the 0.01 level; *correlation is significant at the 0.05 level

3個(gè)地理因子與8個(gè)果實(shí)性狀相關(guān)性的24個(gè)組合中，僅經(jīng)度和總苞裂片寬呈顯著的負(fù)相關(guān)，其他組合相關(guān)性均不顯著。結(jié)果說(shuō)明果實(shí)性狀中僅總苞裂片寬受到地理因子經(jīng)度的影響，經(jīng)度越大，總苞裂片寬越小。而海拔、經(jīng)度和緯度對(duì)其他性狀并無(wú)明顯的影響。

3 討 論

3.1 喜馬拉雅紫茉莉的果實(shí)表型變異

綜合平均值、變異系數(shù)和單因素方差分析結(jié)果得出，總苞筒長(zhǎng)、總苞裂片寬、總苞裂片長(zhǎng)、果長(zhǎng)、果寬、果形、果紋路和百粒重8個(gè)果實(shí)性狀在喜馬拉雅紫茉莉不同居群間都存在極顯著差異，說(shuō)明其果實(shí)性狀變異在不同居群間很豐富，這在一定程度上表明喜馬拉雅紫茉莉有較大的選育潛力，對(duì)其種源利用等有重要指導(dǎo)作用，也對(duì)其種質(zhì)資源的遺傳多樣性的評(píng)價(jià)有一定意義[13]。主成分分析顯示果長(zhǎng)和總苞裂片大小(包括長(zhǎng)和寬)能反映喜馬拉雅紫茉莉居群果實(shí)性狀的大部分信息，是造成各居群間果實(shí)表型差異的主要因素。果實(shí)表型性狀的變異不僅受到內(nèi)部遺傳分化的影響，還與所處的生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)[9]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，喜馬拉雅紫茉莉在西藏主要分布在雅魯藏布江、怒江、瀾滄江及其支流形成的干熱或者干暖河谷中，山體的隔離會(huì)造成不同居群生存的小生境。植物的形態(tài)特征是長(zhǎng)期適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果，通過(guò)個(gè)體水平的表型可塑性實(shí)現(xiàn)對(duì)異質(zhì)環(huán)境的適應(yīng)[10,14]。喜馬拉雅紫茉莉在適應(yīng)外界環(huán)境的過(guò)程中發(fā)生了豐富的形態(tài)變異，也表明喜馬拉雅紫茉莉?qū)Νh(huán)境的適應(yīng)能力很強(qiáng)。另外，內(nèi)在的遺傳因素也是造成其居群間遺傳變異的主要因素之一，還需要進(jìn)一步從分子水平進(jìn)行深入探討。

蘭小中等[3]提及其種子(摻花果)顏色分為黑色和棕色2種，可能與成熟度或者分泌粘液的多少有關(guān)。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)黑色和棕色摻花果之間存在顏色過(guò)渡，不易判斷，反而果實(shí)表面的紋路在調(diào)查的居群中發(fā)現(xiàn)存在棱不明顯，嵴明顯和棱非常明顯2種形態(tài)較易判斷，因此以果紋路作為果實(shí)性狀之一。

3.2 居群水平的聚類分析

本研究依據(jù)果實(shí)性狀進(jìn)行的聚類分析的結(jié)果并沒(méi)有地域分布的規(guī)律性，2個(gè)分支的分布區(qū)域上存在交叉。形成兩個(gè)果實(shí)性狀數(shù)值上有一定差異的分支可能與各分支內(nèi)的居群分布的小生境或遺傳比較相似有關(guān)。而朗縣金東鄉(xiāng)的2個(gè)居群DX和PG雖然地理距離并不遠(yuǎn)，但由于處于同一河流不同流向位置的河谷，2個(gè)居群分別聚類在分支1和2中；據(jù)《西藏植物志》[1]記載，喜馬拉雅紫茉莉原變種在西藏昌都和八宿縣有分布。蔡翠萍等[12]認(rèn)為喜馬拉雅紫茉莉個(gè)體在雄蕊數(shù)目上的豐富變異使其種下分類缺乏有效性狀支持。從本研究聚類結(jié)果上看，昌都的YRC居群和八宿縣的TNC1和TNC2居群雖然均在分支1上，但并未形成獨(dú)立的分支，說(shuō)明文獻(xiàn)記載原變種分布地點(diǎn)居群在果實(shí)形態(tài)上與其他居群并無(wú)區(qū)分，我們由此推測(cè)果實(shí)形態(tài)對(duì)喜馬拉雅紫茉莉種下等級(jí)的區(qū)分分類學(xué)意義不大。

3.3 環(huán)境因子與果實(shí)表型變異的關(guān)系

除總苞裂片寬與經(jīng)度呈顯著的負(fù)相關(guān)外，經(jīng)度、緯度和海拔對(duì)8個(gè)果實(shí)性狀并不存在顯著影響。這可能因?yàn)楸狙芯窟x取的環(huán)境因子有限，而其他更多的環(huán)境因子如溫度、降雨量、土壤成分等可能會(huì)對(duì)喜馬拉雅紫茉莉的表型變異產(chǎn)生影響。