孫濤 杜鳳梅

摘要 目的：動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腸道病毒71型（EV71）陽(yáng)性重癥手足口病患兒外周血Th17、CD4⁺CD25⁺Treg表達(dá)變化及其意義。方法;收治重癥手足口病患兒60例作為重癥組，同期選擇普通組105例，健康對(duì)照組30例。監(jiān)測(cè)各組CD4⁺CD25⁺Treg、Th17及細(xì)胞因子TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17的表達(dá)。結(jié)果：重癥組Th17、IL-6、IL-10、IL-17的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組（P<0.01），而CD4⁺CD25⁺Treg、TGF-β的表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組（P<0.01）。結(jié)論：重癥組手足口病患兒中Th17表達(dá)升高、CD4⁺CD25⁺Treg表達(dá)降低，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估的重要參考指標(biāo)。

關(guān)鍵詞 手足口病;Th17;CD4⁺ CD25⁺ Treg;預(yù)后評(píng)枯

手足口病的病原主要是腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇A組16型，近幾年來(lái)EV71感染的病例在我國(guó)各地皇上升趨勢(shì)。重癥手足口病以EV71感染多見，病情兇險(xiǎn)，并發(fā)癥多，病死率高[1，2]。因此早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療重癥患兒，可提高搶救成功率，挽救患兒生命。

資料與方法

分層隨機(jī)抽樣2016年3月-2016年9月入住我院感染科的手足口病患兒165例，均符合衛(wèi)生部《手足口病診療指南2010版》診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。其中男95例，女70例，年齡10個(gè)月～5歲，平均2.2歲。同期選擇普通組105例，健康對(duì)照組30例。

方法：入組患兒分別于病程第1、5、10天采集EDTA靜脈抗凝血各3mL，分別進(jìn)行檢測(cè)。①Th17、CD4⁺ CD25⁺Treg細(xì)胞的檢測(cè)：對(duì)于Th17細(xì)胞標(biāo)記的處理，首先分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用抗凝管采集外周靜脈血2mL，加入2mL的淋巴細(xì)胞分離液，1000×g離心5min，離心后管內(nèi)容物分為4層，從上往下依次為血漿層、白膜層、淋巴細(xì)胞分離液層、紅細(xì)胞層。用毛細(xì)吸管吸出白膜層中的單個(gè)核細(xì)胞置于清潔離心管內(nèi)，加入4～5mL PBS洗滌2次，棄上清即得所需細(xì)胞。加入CD3-APC、CD8-PE-Cy7流式抗體各5μL，混勻，4℃避光孵育30min。加入1mL PBS洗滌2次，447×g離心5min棄上清。加入100μL破膜/洗滌緩沖液（蒸餾水1：10比例稀釋原液）進(jìn)行細(xì)胞打孔利于細(xì)胞因子染色，室溫避光5min，加入1mL PBS洗滌，447×g離心5min棄上清，此步驟重復(fù)1次，加入100μL破膜/洗滌緩沖液并立即加入5μL PE標(biāo)記的鼠抗人IL-17抗體，室溫避光20min，加1mL PBS靜置30min，期間每隔10min在斡旋震蕩儀上混勻1次，使抗體與細(xì)胞內(nèi)受體充分結(jié)合，447×g離心5min棄上清，重懸細(xì)胞于300～400μL PBS中，充分混勻后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。②血清細(xì)胞因子檢測(cè)：采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)患兒血清TCF-β、IL-6、IL-10和IL-17的含量，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自青島騰輝醫(yī)學(xué)科技有限公司，按說(shuō)明書進(jìn)行操作。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，采用方差分析，各組不同時(shí)間點(diǎn)間計(jì)量資料的比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，同一時(shí)期各組與健康對(duì)照組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

各組外周血TGF-β、IL-6、IL-10和IL-17的表達(dá)比較：病程第1天普通組、重癥組中TGF-β的表達(dá)均低于健康對(duì)照組，且隨病情的加重呈下降趨勢(shì)。IL-6、IL-10和IL-17的表達(dá)均高于健康對(duì)照組，且隨病情的加重呈上升趨勢(shì)。上述各血清細(xì)胞因子組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

各組患者Th17、CD4⁺ CD25⁺Treg細(xì)胞表達(dá)的動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果比較：病程第1d普通組、重癥組Th17的表達(dá)均高于健康對(duì)照組，隨病情的加重呈上升趨勢(shì)。普通組、重癥組CD4⁺ CD25⁺ Treg的表達(dá)均低于健康對(duì)照組，隨病情的加重呈下降趨勢(shì)。各組間免疫指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

重癥組存活與死亡患兒Th17、CD4⁺CD25⁺ Treg細(xì)胞表達(dá)的動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果比較：對(duì)各組Th17、CD4⁺ CD25⁺ Treg的表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在觀察期間存活組Th17的表達(dá)水平明顯低于死亡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CD4⁺CD25⁺Treg的表達(dá)在病程第1天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），隨著病情的進(jìn)展，第5、10天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

重癥組存活與死亡患者Th17、CD4⁺CD25⁺ Treg細(xì)胞表達(dá)測(cè)定：其中Th17細(xì)胞標(biāo)記為CD3⁺ CD8^-IL-17⁺，從淋巴細(xì)胞中選取T細(xì)胞，以CD3⁺ CD8^-確定CD4⁺ T細(xì)胞。

討論

手足口病是由多種腸道病毒引起的兒童常見傳染病，人群對(duì)其普遍易感，且感染后臨床表現(xiàn)輕重不一，輕者僅表現(xiàn)為自限性手足口病或皰疹性咽峽炎，重者可出現(xiàn)腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫或肺出血，甚至心肺衰竭[4，5]。

本研究發(fā)現(xiàn)手足口病組隨病情進(jìn)展Th17的表達(dá)水平逐步增高，IL-17有著相同的表達(dá)趨勢(shì)，CD4⁺ CD25⁺ Treg表達(dá)水平逐步下降。CD4⁺ CD25⁺ Treg細(xì)胞/Th17細(xì)胞平衡失調(diào)的機(jī)制不明確。EV71感染導(dǎo)致CD4⁺ CD25⁺ Treg細(xì)胞/Th17細(xì)胞平衡失調(diào)，考慮可能為EV71感染患兒隨著病情的加重外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)下降，CD4⁺ T細(xì)胞也隨之下降，CD4⁺CD25⁺ Treg比例的降低可能與其有關(guān)。

綜上所述，手足口病患兒體內(nèi)存在免疫功能紊亂，CD4⁺ CD25⁺ Treg細(xì)胞/Th17細(xì)胞表達(dá)的失衡能反應(yīng)手足口病，尤其是重癥患兒機(jī)體免疫抑制狀況。重癥手足口病患兒Th17，CD4⁺ CD25⁺ Treg的表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)病情嚴(yán)重程度及評(píng)估預(yù)后的一項(xiàng)敏感而有效的指標(biāo)，為臨床治療中適時(shí)給予免疫調(diào)節(jié)治療提供理論依據(jù)。Th17、CD4⁺ CD25⁺ Treg檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，值得臨床推廣。

參考文獻(xiàn)

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[5]朱汝南，錢淵，鄧潔，等.北京市兒童手足口病與腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型感染有關(guān)[J].中華流行病學(xué)雜志，2007，28（3）：1004-1008.