張春秋 馬光恕 廉華 李梅 蔣細(xì)良 宿曉琳 劉明鑫 曲虹云

摘要

黃瓜枯萎病是一種土傳真菌病害，在設(shè)施黃瓜栽培中最為常見且危害嚴(yán)重，應(yīng)用生物防治技術(shù)防治該病害對黃瓜安全生產(chǎn)具有重要意義。本研究通過平板對峙試驗(yàn)篩選出3株對黃瓜枯萎病菌抑制率在74%以上的拮抗木霉，分別為棘孢木霉Trichoderma asperellum 525、哈茨木霉T.harzianum 610和擬康氏木霉T. pseudokoningii 886，研究了3種木霉對黃瓜生理特性和幼苗生長作用效應(yīng)及對黃瓜枯萎病的防治效果。結(jié)果表明：3種霉與黃瓜枯萎病菌同時接種的田間防治效果均達(dá)到78%以上，其中棘孢木霉T.asperellum 525的田間防效達(dá)到81.5%。與只接種枯萎病原菌的對照相比，3種木霉與黃瓜枯萎病原菌同時接種或單一接種均可以顯著提高黃瓜葉綠素含量、硝態(tài)氮含量、硝酸還原酶活性、根系活力、根系總吸收面積以及黃瓜株高和莖粗，其中以擬康氏木霉T. pseudokoningii 886促進(jìn)效果最強(qiáng)，葉綠素含量、硝態(tài)氮含量、硝酸還原酶活性、根系活力、根系總吸收面積、根系活躍吸收面積和根系比表面積增加幅度分別達(dá)到38.7%～49.5%、32.1%～33.6%、29.5%～66.3%、10.8%～21.5%、19.6%～23.5%、17.9%～25.0%、4.9%～13.1%，株高、莖粗和全株鮮重增加幅度分別達(dá)到20.7%～28.8%、29.7%～35.1%、10.0%～10.70%。

關(guān)鍵詞

木霉; 黃瓜枯萎病; 生理特性; 防治效果

中圖分類號：

S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018064

Effect of Trichoderma on physiological characteristics of cucumber

seedlings and control effect against Fusarium wilt

ZHANG Chunqiu MA Guangshu LIAN Hua LI Mei

JIANG Xiliang SU Xiaolin LIU Mingxin QU Hongyun3

（1. College of Agriculture， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China;

2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China;

3. Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Horticulture Branch， Harbin 150069， China）

Abstract

Fusarium wilt of cucumber， a kind of soil-borne fungal disease and most common disease， has caused serious harm to cucumber under protected cultivation. The application of biological control technology on cucumber wilt is of great significance to the safe production of cucumber. In this study， three strains of antagonistic Trichoderma， with the inhibition rate of more than 74% on cucumber Fusarium wilt disease， namely T.asperellum 525， T.harzianum 610 and T.pseudokoningii 886， were selected by the method of plate confrontation. The effect of Trichoderma on the physiological characteristics， seedlings growth of cucumber and the control efficacy on cucumber Fusarium wilt were investigated. The results showed that the field control efficacy of simultaneous inoculation of single Trichoderma and pathogen of cucumber Fusarium wilt was above 78%， in which the efficacy of T.asperellum 525 was the highest， up to 81.5%. Compared with the control， in which the pathogen of cucumber Fusarium wilt was inoculated alone， all of treatments， including the inoculation with three Trichoderma plus pathogen of cucumber Fusarium wilt or the inoculation of single Trichoderma， significantly improved cucumber chlorophyll content， nitrate nitrogen content， nitrate reductase activity， root activity， root total absorbing area and actively absorbing area of root and increased plant height and stem diameter. T.pseudokoningii 886 had the strongest effect among them and increased levels of seven physiological indicators mentioned above， with the increase rate from 38.7% to 49.5%， from 32.1% to 33.6%， from 29.5% to 66.3%， from 10.8% to 21.5%， from 19.6% to 235%， from 179% to 25.0% and from 4.9% to 13.1%， respectively. Simultaneously， the rang of increase on plant height， stem diameter or fresh weight of whole plant was from 20.7% to 28.8%， from 29.7% to 35.1% and from 100% to 1070%， respectively.

Key words

Trichoderma; cucumber Fusarium wilt; physiological characteristics; control efficacy

黃瓜Cucumis sativus L.，別名胡瓜，屬于一年生攀緣性草本植物。近年來，設(shè)施黃瓜生產(chǎn)呈現(xiàn)較強(qiáng)勁的發(fā)展態(tài)勢，已成為我國設(shè)施栽培中面積較大、種植范圍較廣的蔬菜作物之一，在2006年就已達(dá)到設(shè)施栽培總面積的60%[1]。由于黃瓜重茬面積越來越大，土傳病害特別是枯萎病逐年加重，導(dǎo)致黃瓜的產(chǎn)量下降、果實(shí)品質(zhì)變劣，制約了設(shè)施黃瓜生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[2]。

黃瓜枯萎病是一種由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮刀菌黃瓜專化型Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum Owen侵染引起的土傳真菌病害[3]，生產(chǎn)上主要以化學(xué)防治為主。應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥可起到一定的防治效果，但存在藥劑持效期短、浪費(fèi)多、易殘留、對人畜傷害大、大面積土壤處理困難等問題。相比之下，生物防治技術(shù)有著安全、無毒、環(huán)保等特點(diǎn)，在防治蔬菜病害方面優(yōu)勢凸顯[4]。

在眾多的生防菌中，木霉Trichoderma spp.以其高效性和廣譜性應(yīng)用最為廣泛，對病原真菌如鐮刀菌Fusarium spp.、腐霉Pythium spp.、疫霉Phytophthora spp.、立枯絲核菌Rhizoctonia solani均有抑制作用[5]。國內(nèi)外的許多關(guān)于木霉的報(bào)道指出，木霉能夠拮抗多種病原真菌，尤其對土傳病原真菌的拮抗作用更加顯著，如程瑩等[6]報(bào)道綠色木霉Trichoderma virideT23、哈茨木霉Ta22對黃瓜枯萎病的相對防效達(dá)到66.04%;莊敬華等[7]報(bào)道黃瓜幼苗經(jīng)綠色木霉T23分生孢子和厚垣孢子處理后，病情指數(shù)由33.69分別降至13.12和10.28，防御酶活性明顯增加。

生理生化活動是生命體的基本過程，通過測定生理指標(biāo)可以研究植物的生命活動規(guī)律，揭示植物生長發(fā)育的規(guī)律與機(jī)理，探索調(diào)節(jié)與控制植物體內(nèi)外環(huán)境條件對其生命活動的影響[8]。有關(guān)木霉改善植物生理代謝、促進(jìn)生長的研究較多，如王濤等[9]報(bào)道黃瓜幼苗根系接種菌根后，葉片中的葉綠素a和葉綠素b含量均有所增加，凈光合速率也維持在一個較高的水平;陳伯清等[10]報(bào)道稀釋50倍的木霉HT-03孢子懸浮液滴涂于番茄幼苗葉片能明顯提高幼苗葉片的葉綠素含量，從而促進(jìn)番茄幼苗的生長發(fā)育;張敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)，木霉 L24 菌株浸種與噴施兩種方式處理對小麥葉面積和苗高均有促進(jìn)作用，可有效提高小麥葉綠素含量和根系活力。

以上研究多從單方面研究了木霉對黃瓜枯萎病的防治效果或是對黃瓜植株某一生理特性的影響，關(guān)于木霉施用后黃瓜植株內(nèi)部生理變化以及對黃瓜枯萎病的防治效果缺乏系統(tǒng)研究。本研究擬采用平板對峙試驗(yàn)篩選出幾株對黃瓜枯萎病有顯著防治效果的木霉，制備木霉發(fā)酵劑和病原菌孢子懸浮液，并設(shè)計(jì)不同試驗(yàn)處理，研究不同木霉對黃瓜生理特性和幼苗生長的作用效應(yīng)及對黃瓜枯萎病的防治效果，為后期木霉菌劑系統(tǒng)開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)，為黃瓜設(shè)施安全、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)栽培提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃瓜品種：‘長春密刺，購買于山東新泰市裕園種業(yè)有限公司。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂10 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，供菌落生長。 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL， pH自然，供菌絲培養(yǎng)。

供試菌株：供試木霉由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所木霉研究組提供。菌株編號、名稱和拉丁名見表1。

黃瓜枯萎病菌：枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum Owen，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所土傳病害生物防治研究組提供。

供試土壤：草炭土，土壤過1 mm 篩后于烘箱中160℃高溫滅菌2 h，自然冷卻后繼續(xù)160℃烘2 h后放涼備用。

表1 供試木霉

Table 1 Trichoderma spp. used in the test

1.2 防治枯萎病木霉菌株篩選

將木霉菌株接種于 PDA 平板，28℃培養(yǎng)3 d;將黃瓜枯萎病菌接種于PDA平板，28℃培養(yǎng)5 d。分別用 5 mm 打孔器打取培養(yǎng)好的木霉和黃瓜枯萎病菌菌落邊緣菌塊接種于PDA 平板，距平板邊緣1 cm處相對放置，28℃培養(yǎng)。設(shè)僅接種黃瓜枯萎病菌為對照，3次重復(fù)。培養(yǎng)7 d后測量病原菌生長半徑以及木霉對枯萎病菌的覆蓋情況，參照陳書華等[12]的方法，計(jì)算抑制率，確定覆蓋指數(shù)，以覆蓋率級別表示。

抑制率=（對照枯萎病菌菌落半徑-對峙培養(yǎng)枯萎病菌菌落半徑）/對照枯萎病菌菌落半徑×100%;

覆蓋率分級標(biāo)準(zhǔn)（3級）：Ⅰ級，木霉菌落與病原菌菌落不接觸，菌絲不能覆蓋病原菌菌落;Ⅱ級，木霉菌絲覆蓋病原菌菌落1/2以下，病原菌菌落健康，顏色無變化;Ⅲ級，木霉菌絲全部覆蓋病原菌菌落，并在病原菌菌落上大量產(chǎn)孢，病原菌菌落萎縮，顏色變暗。

1.3 木霉發(fā)酵液和病原菌孢子懸浮液的制備

木霉發(fā)酵液的制備：將平板對峙培養(yǎng)篩選出的木霉分別在PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗條件培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅5塊，接種在含有100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）的250 mL三角瓶中，在搖床（250 r/min）28℃黑暗條件下振蕩培養(yǎng)7 d，制成木霉發(fā)酵液。用血球計(jì)數(shù)板測定孢子數(shù)，并將木霉發(fā)酵液的孢子數(shù)調(diào)整到1.5×108個/mL備用。

病原菌孢子懸浮液的制備：將黃瓜枯萎病菌在PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅5塊，接種在含有100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）的250 mL三角瓶中，在28℃黑暗條件下?lián)u床（250 r/min）振蕩培養(yǎng)7 d，得到病原菌孢子懸浮液。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定孢子懸浮液的孢子數(shù)，并將孢子數(shù)稀釋至1×105個/mL。

1.4 盆栽試驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)基地現(xiàn)代化溫室內(nèi)進(jìn)行，取滅菌試驗(yàn)土裝入塑料育苗盤（34.5 cm×24 cm×11 cm）中，每盤播種催芽后的黃瓜種子120粒，出苗后均勻保留50株。播種后每2 d澆施1 000 mL無菌水，保持黃瓜正常生長狀態(tài)。

黃瓜播種后5 d，即真葉初展時，挑選長勢較一致的黃瓜，利用木霉發(fā)酵液和病原菌孢子懸浮液進(jìn)行灌根接種。每棵黃瓜苗的根莖部加入3 mL相應(yīng)的接種液即每盤加入150 mL的接種量。試驗(yàn)設(shè)置9個處理，每個處理3盤，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置5次重復(fù)。

處理如下：① 棘孢木霉T.asperellum 525和枯萎病菌同時接種（T1B）;② 哈茨木霉T.harzianum 610和枯萎病菌同時接種（T2B）;③ 擬康氏木霉T. pseudokoningii 886和枯萎病菌同時接種（T3B）;④ 只接種枯萎病菌（B）;⑤ 50%多菌靈可濕性粉劑800倍液與枯萎病菌同時接入（化學(xué)對照，CB）;⑥ 只接種棘孢木霉T.asperellum 525（T1）;⑦ 只接種哈茨木霉T.harzianum 610（T2）;⑧ 只接種擬康氏木霉T. pseudokoningii 886（T3）;⑨ 只接種PD液體培養(yǎng)基（空白對照，P）。

1.4.2 試驗(yàn)測定指標(biāo)與方法

播種后12 d 取樣，對黃瓜幼苗生理指標(biāo)、生長指標(biāo)和抗病性指標(biāo)進(jìn)行測定。

葉綠素含量測定采用丙酮乙醇法;葉片硝態(tài)氮含量采用酚二磺酸法;根系活力采用α-萘胺氧化法測定;葉片硝酸還原酶活性采用活體分光光度法;根系總吸收面積、活躍吸收面積、比表面積的測定采用甲烯藍(lán)法。

莖粗：子葉節(jié)下1 cm處粗度，用游標(biāo)卡尺測定;株高：莖基部到生長點(diǎn)之間的距離，用直尺測定。植株鮮重：植株利用清水反復(fù)沖洗，再用吸水紙吸干，用1/1000電子天平測定。

抗病性指標(biāo)測定：包括植株成活率、發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果。

黃瓜苗期枯萎病參照張素平的分級標(biāo)準(zhǔn)[13]，病情指數(shù)計(jì)算參照宗兆鋒和康振生[14]的方法。0級：無癥狀;1級：真葉、子葉黃化或萎蔫面積不超過總面積的50%;2級：真葉、子葉黃化或萎蔫面積超過總面積的50%;3級：葉片萎蔫或枯死，僅生長點(diǎn)存活;4級：全株嚴(yán)重萎蔫，以致枯死。

植株成活率和發(fā)病率分別為播種后12 d各處理成活株數(shù)和發(fā)病株數(shù)占調(diào)查總株數(shù)的百分比。

病情指數(shù)=[∑（病級株數(shù)×代表級數(shù)）/（植株總數(shù)×最高代表級值）]×100;

防治效果=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行圖表制作，試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，利用DPS 7.05（data processing system）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜枯萎病生防木霉菌株篩選

平板對峙試驗(yàn)篩選獲得3株對黃瓜枯萎病菌抑制率在74%以上的木霉菌株，其中棘孢木霉T.asperellum 525的抑制率最高，為80.24%，覆蓋指數(shù)為Ⅲ級;其次是哈茨木霉T.harzianum 610的抑制率為76.86%，覆蓋指數(shù)為Ⅲ級;再次是擬康氏木霉T.pseudokoningii 886的抑制率為74.17%，覆蓋指數(shù)為Ⅲ級（表2）。

表2 平板對峙試驗(yàn)篩選獲得的對黃瓜枯萎病菌拮抗效果較好的木霉菌株

Table 2 Antagonistic Trichoderma spp. on Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum selected by confrontation in vitro

2.2 木霉對黃瓜幼苗生理特性的影響

2.2.1 木霉對黃瓜幼苗硝酸還原酶活性和葉綠素含量的影響

由圖1可見，木霉和病原菌混合接種處理（T1B、T2B、T3B）的葉片硝酸還原酶活性均顯著高于只接種枯萎病菌（B）的處理，表明木霉和病原菌混合處理具有減輕枯萎病菌對植株葉片硝酸還原酶活性的抑制作用。擬康氏木霉886和枯萎病菌同時接種（T3B）的黃瓜幼苗葉片硝酸還原酶活性顯著高于棘孢木霉525和哈茨木霉610分別與枯萎病菌同時接種（T1B、T2B）以及50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時處理（CB）;棘孢木霉525和枯萎病菌同時接種（T1B）處理顯著高于哈茨木霉610和枯萎病菌同時接種（T2B）;T2B和CB處理差異不顯著。

只接種木霉（T1、T2、T3）的黃瓜幼苗葉片硝酸還原酶活性均顯著高于木霉和病原菌混合接種處理（T1B、T2B、T3B），說明三種木霉菌單獨(dú)處理對激活葉片硝酸還原酶活性作用更顯著;擬康氏木霉886處理（T3）顯著高于棘孢木霉525處理（T1）和哈茨木霉610處理（T2）。T1、T2、T3處理的硝酸還原酶活性均顯著高于CB、B和P處理。

擬康氏木霉886單獨(dú)處理（T3）的黃瓜幼苗葉片葉綠素含量最高，顯著高于其他兩種木霉單獨(dú)處理及木霉與枯萎病菌混合處理。擬康氏木霉886和枯萎病菌同時接種（T3B）的黃瓜幼苗葉片葉綠素含量略低于擬康氏木霉886單獨(dú)處理，但顯著高于棘孢木霉525和哈茨木霉610分別與枯萎病菌同時接種（T1B、T2B）、50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時處理（CB）、只接種枯萎病菌（B）的處理和PD液體培養(yǎng)基（P）處理;T1B與CB之間差異不顯著但二者均顯著高于T2B和B;T2B處理顯著高于B;P處理顯著高于T1、T2處理，后二者之間差異不顯著。以上結(jié)果說明不同木霉對葉綠素含量或減輕枯萎病菌對植株葉綠素含量的影響存在差異。

圖1 木霉對黃瓜幼苗硝酸還原酶活性和葉綠素含量的影響

Fig.1 Effect of Trichoderma on nitrate reductase activity and chlorophyll content of cucumber seedlings

2.2.2 木霉對黃瓜幼苗葉片硝態(tài)氮含量和根系活力的影響

由圖2可見，棘孢木霉525、哈茨木霉610和擬康氏木霉886分別與枯萎病菌同時接種（T1B、T2B、T3B），與50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時處理（CB）的黃瓜幼苗葉片硝態(tài)氮含量相當(dāng)，均顯著高于只接種枯萎病菌（B）的處理;擬康氏木霉886與枯萎病菌同時接種（T3B）顯著高于哈茨木霉610和病原菌同時處理（T2B）;表明木霉或50%多菌靈WP 800倍液和病原菌混合處理具有減輕枯萎病原菌對植株葉片硝態(tài)氮含量的抑制作用。

只接種擬康氏木霉886（T3）、哈茨木霉610（T2）和棘孢木霉525（T1）的處理與50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時處理（CB）的黃瓜幼苗葉片硝態(tài)氮含量相當(dāng)，但均顯著高于只接種枯萎病菌處理（B）和PD液體培養(yǎng)基處理（P）;擬康氏木霉和病原菌同時處理（T3B）與其單獨(dú)處理（T3）的葉片硝態(tài)氮含量差異不顯著。以上結(jié)果說明木霉菌對葉片硝態(tài)氮含量的影響在不同木霉之間存在差異，這與其對葉綠素含量影響規(guī)律相類似。

不同處理對黃瓜幼苗根系活力的影響測定結(jié)果表明，單獨(dú)接種木霉菌的處理（T1、T2、T3），其幼苗根系的活力均顯著高于與枯萎病菌混合接種的處理（T1B、T2B、T3B），其中擬康氏木霉886顯著改善黃瓜幼苗根系的活力，經(jīng)其處理（T3）的黃瓜幼苗處理的根系活力顯著高于其他處理。三種木霉與枯萎病菌混合處理的黃瓜幼苗根系的活力均顯著高于只接種枯萎病菌（B）的處理，說明木霉和病原菌混合處理均具有減輕枯萎病原菌對根系活力的抑制作用，這與葉片硝酸還原酶活性變化規(guī)律相類似。

圖2 木霉對黃瓜幼苗硝態(tài)氮含量和根系活力的影響

Fig.2 Effect of Trichoderma on nitrate nitrogen content and root activity of cucumber seedlings

2.2.3 木霉對黃瓜幼苗根系總吸收面積、活躍吸收面積和比表面積的影響

由圖3可見，黃瓜幼苗根系總吸收面積最大的為擬康氏木霉886單獨(dú)處理（T3），其次為與枯萎病菌同時接種的處理（T3B），二者差異不顯著，其中T3處理顯著高于T1、T2、T1B和T2B。不論是三種木霉和枯萎病菌同時接種的處理，還是單獨(dú)接種木霉的處理，黃瓜幼苗根系總吸收面積均顯著高于只接種枯萎病菌的處理（B）和只接種PD液體培養(yǎng)基（P）處理。除哈茨木霉610與枯萎病菌同時接種的處理（T2B）根系總吸收面積與50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時接種的處理（CB）相當(dāng)外，其余接種了木霉的處理（T1、T2、T3、T1B和T3B）黃瓜幼苗根系總吸收面積均顯著高于CB。表明木霉或50%多菌靈WP 800倍液和病原菌混合處理具有減輕枯萎病菌對植株根系總吸收面積的抑制作用，不同木霉對黃瓜幼苗根系總吸收面積的影響存在差異。

黃瓜幼苗根系活躍吸收面積變化特點(diǎn)與根系總吸收面積類似。單獨(dú)接種木霉的處理（T1、T2、T3）和木霉與枯萎病菌同時接種的處理（T1B、T2B和T3B）黃瓜幼苗根系活躍吸收面積均顯著高于只接種

枯萎病菌處理（B）和接種PD液體培養(yǎng)基處理（P）。除單獨(dú)接種擬康氏木霉886的處理（T3）外，其余接種木霉的處理（單獨(dú)接種及與病原菌混合接種處理）的黃瓜幼苗根系活躍吸收面積與50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時處理（CB）差異均不顯著。表明木霉或50%多菌靈WP 800倍液和病原菌混合處理具有減輕枯萎病原菌對植株根系活躍吸收面積的抑制作用。不同木霉對黃瓜幼苗根系活躍吸收面積的影響存在差異。

黃瓜幼苗根系比表面積變化特點(diǎn)總體上與根系總吸收面積類似。除哈茨木霉和枯萎病菌同時接種的處理（T2B）、棘孢木霉與枯萎病菌同時接種處理（T1B）和哈茨木霉單獨(dú)接種處理（T2）與只接種枯萎病菌的處理（B）沒有顯著差異外，其余接種木霉的處理（單獨(dú)接種及與病原菌混合接種處理）黃瓜幼苗根系比表面積均顯著高于B處理;除單獨(dú)接種擬康氏木霉886的處理（T3）外，其他接種木霉的處理（T1、T2、T1B、T2B、T3B）與50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時處理（CB）之間差異不顯著。表明木霉或50%多菌靈WP 800倍液和病原菌混合處理具有減輕枯萎病原菌對植株根系比表面積的抑制作用。不同木霉對根系比表面積的影響存在差異。

圖3 木霉對黃瓜幼苗根系總吸收面積、活躍吸收面積和比表面積的影響

Fig.3 Effect of Trichoderma on the root total absorbing area， active absorbing area and specific surface of cucumber seedlings

2.3 木霉對黃瓜幼苗生長的影響

由圖4可見，相較于只接種PD液體培養(yǎng)基處理（P），接種木霉能顯著促進(jìn)黃瓜幼苗的株高和莖粗，其中單獨(dú)接種棘孢木霉525（T1）和擬康氏木霉886（T3）的黃瓜幼苗的株高顯著高于其他接種木霉的處理（T2、T1B、T2B、T3B）;只接種擬康氏木霉886（T3）的黃瓜幼苗的莖粗顯著高于其他接種木霉的處理（T1、T2、T1B、T2B、T3B）。枯萎病菌對黃瓜幼苗的株高有明顯的抑制作用，單獨(dú)接種枯萎病菌的處理（B）的株高顯著低于只接種PD液體培養(yǎng)基處理（P）;多菌靈在一定程度上能夠緩解枯萎病菌對黃瓜幼苗株高的抑制作用，但對莖粗的影響不明顯，50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時處理（CB）的黃瓜幼苗的株高顯著高于只接種PD液體培養(yǎng)基（P）處理。

不同木霉及木霉與枯萎病菌組合處理對黃瓜幼苗鮮重的影響不同，棘孢木霉525和擬康氏木霉886單獨(dú)接種（T1、T3）及其與枯萎病菌同時接種（T1B、T3B）的黃瓜幼苗鮮重顯著高于只接種PD液體培養(yǎng)基（P）處理，顯示出對鮮重的促進(jìn)作用;其中，擬康氏木霉886和枯萎病菌同時接種（T3B）對全株鮮重的影響與擬康氏木霉886單獨(dú)接種的影響一致，二者沒有顯著差異。哈茨木霉610單獨(dú)接種（T2）與只接種PD液體培養(yǎng)基處理（P）沒有差異，表明其對鮮重沒有影響，而哈茨木霉610與枯萎病菌同時接種（T2B）、只接種枯萎病菌（B）和50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時處理（CB）的黃瓜幼苗的鮮重顯著低于只接種PD液體培養(yǎng)基（P）處理，顯示出對鮮重的抑制作用。

圖4 木霉對黃瓜幼苗生長的影響

Fig.4 Effect of Trichoderma on the growth of cucumber seedlings

2.4 木霉對黃瓜枯萎病的防治效果

與單獨(dú)接種枯萎病菌（B）相比，棘孢木霉525、哈茨木霉610、擬康氏木霉886、50%多菌靈WP 800倍液分別與病原菌同時處理均能顯著提高黃瓜幼苗的成活率，降低黃瓜枯萎病菌的發(fā)病率（表3）。三種木霉分別與枯萎病菌同時接種（T1B、T2B、T3B）對黃瓜幼苗成活率的提高、黃瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)的降低沒有顯著差異，但均顯著優(yōu)于50%多菌靈WP 800倍液和病原菌同時處理（CB），可能是因?yàn)樵邳S瓜長期生產(chǎn)中，化學(xué)藥劑的反復(fù)使用使病菌產(chǎn)生抗藥性，這有待于進(jìn)一步研究。

表3 木霉對黃瓜枯萎病的防治效果1）

Table 3 Control efficacy of Trichoderma against cucumber Fusarium wilt

1） 表中的數(shù)值分別代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同一列中的小寫字母和大寫字母分別表示差異達(dá)0.05和0.01水平。

Data in the table are mean values±SD，different lowercase and capital letters within the same column mean significant difference at 0.05 and 0.01 probability level， respectively.

3 結(jié)論與討論

Abo-Elyousr等[15]有關(guān)木霉與黃瓜枯萎病的平板對峙和溫室盆栽研究表明，木霉菌株對該病菌的拮抗作用并不與盆栽防效呈正相關(guān)。同時，朱萍萍等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，平板拮抗試驗(yàn)中對黃瓜枯萎病菌抑菌效果達(dá)75% 以上的菌株，其田間盆栽防效卻平均在40% 以下，遠(yuǎn)低于離體拮抗效果。這可能是因?yàn)槟久共煌暝谄桨逶囼?yàn)和盆栽試驗(yàn)中的生長速度具有差異：木霉生長速度快，在平板上生長時具有明顯的競爭優(yōu)勢，而在盆栽試驗(yàn)中，木霉的生長優(yōu)勢不一定能體現(xiàn)出來。而本研究從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所木霉研究組提供的9種菌株中，利用平板對峙法獲得3株對黃瓜枯萎病菌抑制率在74%以上、覆蓋指數(shù)為Ⅲ級的菌株，分別為棘孢木霉525、哈茨木霉610和擬康氏木霉886，其中棘孢木霉525對黃瓜枯萎病菌的抑制率達(dá)到80.24%。在苗期盆栽試驗(yàn)中，以只接種病原菌為對照（B），3種木霉分別與黃瓜枯萎病菌同時接種田間防治效果均達(dá)到78%以上，其中棘孢木霉525與病菌同時接種田間防治效果最高，達(dá)到81.53%，與平板對峙試驗(yàn)中其對黃瓜枯萎病菌的生長抑制率有較好的一致性。謝紅輝等[17]從桑樹根際土壤中分離出8個對桑樹根腐病有抑制作用的菌株，其中以YZ14-3在平板對峙試驗(yàn)中的抑菌效果最好，其大田防治試驗(yàn)的生防效果也高達(dá)67.94%，與本研究結(jié)果較接近。因此，平板對峙試驗(yàn)可以作為黃瓜枯萎病拮抗木霉篩選的依據(jù)之一。

生產(chǎn)上利用木霉防治黃瓜枯萎病已有較多的研究，如陳芳等[18]報(bào)道枯草芽胞桿菌B579對黃瓜枯萎病的抑制作用達(dá)73.6%;李書強(qiáng)等[19]利用棘孢木霉Trichoderma asperellum防治黃瓜枯萎病的效果達(dá)70.24%;谷祖敏等[20]研究發(fā)現(xiàn)，不同木霉菌株對黃瓜枯萎病菌的防效具有明顯差異，其中哈茨木霉TH菌株對黃瓜枯萎病的作用最強(qiáng)，防效為64.34%;而綠色木霉Trichoderma viride TV菌株對黃瓜枯萎病防效為47.49%;長枝木霉Trichoderma longibrachiatum TL菌株對黃瓜枯萎病防效最低，僅為6.34%。在本研究中的3株木霉對黃瓜枯萎病的田間防效均高于78%，病情指數(shù)均由對照的49.93降低到9.12～10.55，顯示這3株木霉對黃瓜枯萎病的防效高于文獻(xiàn)報(bào)道，有良好的田間應(yīng)用前景。

木霉不僅能通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性及局部抗性等發(fā)揮生防作用[21]，還能顯著促進(jìn)各類植物的生長[22-23]。景芳等[24]研究發(fā)現(xiàn)，施入長枝木霉 T6 水分散粒劑對黃瓜生長具有明顯的促進(jìn)作用，能夠顯著提高黃瓜幼苗株高、莖粗、根系長度等生長指標(biāo)，提高了和抗性相關(guān)的葉綠素、可溶性糖以及蛋白質(zhì)含量，增強(qiáng)了過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。袁揚(yáng)等[25]從鴨茅Dactylis glomerata L.根際分離篩選獲得5 株優(yōu)良木霉促生菌株，研究發(fā)現(xiàn)：這些木霉菌株處理的鴨茅植株葉片及根部丙二醛（MDA）含量均低于對照，葉片葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量得到大幅提升，能夠提高鴨茅植株的抗性，從而促進(jìn)鴨茅生長。根系活力、根系總吸收面積、活躍吸收面積、根系表面積是反映根系對養(yǎng)分吸收能力的重要指標(biāo)[26]。張良等[27]利用長柄木霉Trichoderma longibrachiatum和涇陽鏈霉菌Streptomyces jingyangensis復(fù)配，顯著提高了煙苗的根系體積和根系總表面積，提高了煙苗防御性酶活性，對煙草黑脛病的相對防治效果達(dá)到了69.3%。在本試驗(yàn)條件下，接種棘孢木霉525、哈茨木霉610、擬康氏木霉886均能明顯提高黃瓜幼苗葉綠素含量、硝態(tài)氮含量、硝酸還原酶活性、根系活力、根系總吸收面積、根系活躍吸收面積和根系比表面積，與其研究結(jié)論相類似。而谷祖敏等[20]的研究則發(fā)現(xiàn)，不同木霉菌株對黃瓜幼苗生長的促進(jìn)作用和對枯萎病防治效果并不一致：防病效果較差的綠色木霉TV菌株（對枯萎病防效為47.49%）對黃瓜生長促進(jìn)作用最強(qiáng)，地上部和地下部鮮重分別增加42.81%和86.92%;而防病效果最好的哈茨木霉TH菌株（對枯萎病防效為64.34%）對黃瓜生長促進(jìn)作用最差，地上部和地下部鮮重分別增加16.46%和24.62%，這是生防菌不同作用效果的體現(xiàn)，研究不同木霉菌的生防機(jī)制仍是以后的工作重點(diǎn)之一。