劉宏毅，陳慧潔，李慧敏，葉小真，馮麗貞，郭朦朦

(福建農(nóng)林大學(xué) a 林學(xué)院，b 金山學(xué)院，福建 福州 350002)

在大多數(shù)原核生物和所有真核生物中，鐵元素是各種生命活動的必需元素。地殼中鐵元素儲量豐富，但其難溶性大大限制了真菌對鐵的直接吸收。在生境中鐵元素含量較低時，大多數(shù)微生物和部分植物通過分泌鐵載體與Fe3+結(jié)合為鐵載體-鐵化合物來獲取鐵元素[1]。大多數(shù)真菌存在4種異羥肟酸型鐵載體，分別為鐮孢氨酸、糞生素、鐵色素和羅丹明酸，其主要由非核糖體肽合成酶(NRPSs，non-ribosomal peptide synthetases)來合成[2]。鐵載體-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Siderophore iron transporter，SIT)屬于MFS(Major facilitator superfamily)超家族，在缺鐵生境下通過轉(zhuǎn)運(yùn)鐵載體-鐵化合物為微生物的生長發(fā)育提供鐵元素。SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有典型的MFS結(jié)構(gòu)域，家族成員大多數(shù)由400～600個氨基酸殘基組成，N端和C端均位于胞內(nèi),MFS蛋白的二級結(jié)構(gòu)大多含有12個跨膜α螺旋，僅少數(shù)含有6，14或24個[3-4]，目前已知的SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均含有14個跨膜α螺旋，多出的2個跨膜螺旋是由胞內(nèi)中間的環(huán)狀區(qū)(loop)插入膜中產(chǎn)生的。因此，雖然少數(shù)蛋白成員含有的跨膜α螺旋數(shù)目不同，但是并不影響MFS超家族整體的蛋白折疊方式,即MFS折疊[5]。MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制由搖桿開關(guān)和門控運(yùn)輸理論組成[6-8]，MFS蛋白的N端或C端的跨膜螺旋圍繞著底物結(jié)合位點一側(cè)關(guān)閉一側(cè)開放以進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為鐵載體-鐵化合物的運(yùn)輸載體發(fā)揮著重要作用，如禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)FgSit1基因編碼的SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)調(diào)控鐵載體-鐵化合物FC-Fe3+的吸收[9]，構(gòu)巢曲霉(Aspergillusfumigatus)的SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MirB與鐵載體-鐵化合物三乙酰鐮孢氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[10]，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Arn1p轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過轉(zhuǎn)運(yùn)生境中的鐵載體-鐵化合物來獲取鐵元素[11]。

桉樹焦枯病(Calonectriapseudoreteaudii)是熱帶和亞熱帶地區(qū)桉樹種植區(qū)危害最為嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重威脅桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[12]。桉樹焦枯病由麗赤殼屬(Calonectria)真菌引起，其無性態(tài)為帚梗柱孢屬(Cylindrocladium)真菌[13]。據(jù)統(tǒng)計，Calonectria現(xiàn)有集群13個共71種，其中Calonectriapseudoreteaudii是福建省內(nèi)發(fā)現(xiàn)最早、分布最廣、致病力最強(qiáng)的病原菌株[14-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在焦枯病菌侵染桉樹48 h時上調(diào)表達(dá)，可能在病原菌侵染寄主的過程中，CpSit1基因通過調(diào)控鐵載體-鐵化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)完成鐵元素的攝入，進(jìn)而協(xié)助焦枯病菌在桉樹中的定植[17]。為了解CpSit1基因在桉樹焦枯病菌中是否為單拷貝基因，本研究通過多種生物信息學(xué)軟件在全基因組范圍內(nèi)對焦枯病菌SIT蛋白家族進(jìn)行鑒定，并對其編碼基因、結(jié)構(gòu)域、跨膜螺旋、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行分析和功能預(yù)測，進(jìn)一步通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行多菌種比較分析，并通過qPCR分析SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在焦枯病菌侵染桉樹48 h后的表達(dá)情況，以期為揭示SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在焦枯病菌鐵元素攝入機(jī)制及鐵載體-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在焦枯病菌侵染桉樹過程中所扮演的角色奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因組序列來源

桉樹焦枯病菌(Calonectriapseudoreteaudii,菌株：YA51)基因組NCBI檢索號為MOCD01000000。禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum,菌株：PH-1)、粗糙脈胞菌(Neurosporacrassa，菌株：OR74A)、稻瘟菌(Magnaportheoryzae,菌株：70-15)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea，菌株：B05-10)的基因組數(shù)據(jù)及蛋白序列數(shù)據(jù),均下載自Broad Institute(www.broadinstitute.org/)數(shù)據(jù)庫。

1.2 試驗方法

1.2.1 SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定 從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載所有真菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白序列，通過MAFFT軟件進(jìn)行多重比較；然后通過HMMER軟件(http://hmmer.org/)的hmmbuild功能構(gòu)建隱馬可夫(HMM,Hidden Markov Model)模型，用hmmsearch功能將其與桉樹焦枯病菌、禾谷鐮刀菌、粗糙脈胞菌、稻瘟菌和灰葡萄孢的蛋白序列庫進(jìn)行比對，E值設(shè)定為1×10-10；進(jìn)一步用hmmsearch分析結(jié)果再次構(gòu)建隱馬可夫模型后用hmmsearch進(jìn)行迭代搜索；最后通過與TCDB(Transporter Classification Database, http://www.tcdb.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，最終獲得這5個菌種的SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

1.2.2 結(jié)構(gòu)域預(yù)測 采用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)在線分析功能進(jìn)行SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.2.3 跨膜螺旋預(yù)測 采用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜螺旋進(jìn)行預(yù)測。

1.2.4 亞細(xì)胞定位預(yù)測 采用WoLF PSORT在線工具(https://wolfpsort.hgc.jp/)對SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 采用mafft軟件[18]對禾谷鐮刀菌、稻瘟菌、灰葡萄孢、粗糙脈胞菌和桉樹焦枯病菌的SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行多重比對，以禾谷鐮刀菌的DHA14(drug:H+antiporter 14 spanner)蛋白TRI102為外群，然后用Gblock軟件去除冗余序列，最后用Neighbor-Joining法通過MEGA7.0[19]構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹。bootstrap檢測值設(shè)為1 000次，其余參數(shù)均為系統(tǒng)默認(rèn)值，對重復(fù)率小于50%的分支進(jìn)行合并。

1.2.6 SIT基因表達(dá)分析 基于焦枯病菌侵染桉樹48 h的數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)(Digital Gene Expression profiling，DGE)，獲得桉樹焦枯病菌SIT基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況[20]，并將其表達(dá)情況標(biāo)注在系統(tǒng)發(fā)育樹中。采用與DGE分析相同的方法制備樣品，然后進(jìn)行總RNA提取、PCR反轉(zhuǎn)錄及實時熒光PCR，其中總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)、實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。采用Talent qPCR PreMix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為：2×Talent qPCR Mix 10.0 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，cDNA模板1.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，并加RNase-Free ddH2O至20 μL。采用Beacon Design 7.9軟件進(jìn)行引物設(shè)計(表1)，委托生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計算焦枯病菌SIT基因的表達(dá)量。

表1 桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的引物Table 1 Primers of SIT transporters in Calonectria pseudoreteaudii

2 結(jié)果與分析

2.1 SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定

通過對桉樹焦枯病菌全基因組進(jìn)行hmmsearch分析，從14 355條序列中共鑒定出16個SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(表2)，約占總編碼蛋白的0.11%。序列分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白序列長度大多數(shù)為400～603個氨基酸，編碼這些蛋白序列的ORF(Open reading frame)閱讀框位于不同的基因組支架(Scaffold)上。桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白序列與TCDB數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果(表2)顯示，其主要分為13個鐵-鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ferri-siderophore transporter，TCID:2.A.1.16.7)、2個鐵載體-鐵:H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Siderophore-iron:H+symporter，TCID：2.A.1.16.1)和1個鐵載體-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Siderophore iron transporter，TCID:2.A.1.16.6)。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果(表2)顯示，除CpSit13轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上外，其余均在細(xì)胞膜上。

2.2 結(jié)構(gòu)域及跨膜螺旋分析

保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，16個桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均為MFS結(jié)構(gòu)域(圖1)，其InterPro ID為IPR020846。SIT蛋白結(jié)構(gòu)域長短不一，長度為24～524個氨基酸，其中CpSit4、CpSit8、CpSit10、CpSit11和CpSit13分為2段；CpSit1和CpSit5分為3段。CpSit1的2段長度較為接近的結(jié)構(gòu)域的一致性為21%，CpSit5 的2段長度較為接近的結(jié)構(gòu)域的一致性為23%，說明CpSit1和CpSit5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化晚期通過單個結(jié)構(gòu)域復(fù)制而來的可能性較低。

表2 桉樹焦枯病菌SIT蛋白的相關(guān)信息Table 2 Information of siderophore-iron transporters in Calonectria pseudoreteaudii

圖1 桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)域Fig.1 Conserved domains of Siderophore-iron transporters in Calonectria pseudoreteaudii

TMHMM分析(表2)發(fā)現(xiàn)，CpSit3含有12個跨膜螺旋，CpSit5、CpSit11和CpSit15均含有13個，CpSit7含有11個，CpSit8含有10個，其余均含有14個跨膜螺旋。此外，CpSit8的蛋白長度及結(jié)構(gòu)域長度明顯小于其他SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其跨膜螺旋數(shù)僅為10個，與典型SIT蛋白的跨膜螺旋數(shù)量不符，這可能是基因復(fù)制過程中結(jié)構(gòu)遺失或基因組拼裝錯誤所致。雖然部分桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜α螺旋數(shù)目不盡相同，但并不影響整體的蛋白折疊方式，其跨膜螺旋較為均勻地分布在N端和C端，為典型的MFS折疊。因此推測SIT蛋白與底物結(jié)合后，其N端或C端的跨膜螺旋圍繞著底物結(jié)合位點一側(cè)關(guān)閉一側(cè)開放進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。以上結(jié)果表明，桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)特征較為保守，可能具有活性和功能。

2.3 不同物種間SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的比較

通過hmmsearch共從禾谷鐮刀菌、稻瘟菌、粗糙脈胞菌、灰葡萄孢和桉樹焦枯病菌中發(fā)現(xiàn)34個SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中禾谷鐮刀菌8個,稻瘟菌3個,粗糙脈胞菌2個,灰葡萄孢5個，而桉樹焦枯病菌有16個SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，存在明顯擴(kuò)張。對上述SIT蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)域均為MFS結(jié)構(gòu)域。

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)其分支聚為3大類，分別為鐵載體-鐵:H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵載體-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和外群TRI102蛋白，表明這些SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有明顯的直系同源關(guān)系，來源于共同的祖先基因且在進(jìn)化中十分保守。桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在進(jìn)化樹中分別聚在不同分支中，不存在單拷貝狀況。在禾谷鐮刀菌、稻瘟菌、粗糙脈胞菌、灰葡萄孢和桉樹焦枯病菌中，僅禾谷鐮刀菌和焦枯病菌分別含有2個鐵載體:H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這種在特定菌種中特有的SIT，可能暗示著與這2個菌種相應(yīng)的生物學(xué)功能存在相關(guān)性，但具體情況還有待后續(xù)研究。

(1)紅色分支為鐵載體-鐵：H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，藍(lán)色分支為鐵載體-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，綠色分支為外群TRI102蛋白；(2)五邊形標(biāo)記部分為桉樹焦枯病菌SIT蛋白轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，黃色代表上調(diào)，褐色代表下調(diào)，灰色代表表達(dá)不顯著(1)The red branch represents the Siderophore-iron:H+ Symporter,the blue branch represents the Siderohore iron transporter and the green color represents the outgroup TRI102 protein;(2)The pentagon is the expression of SIT protein in Calonectria pseudoreteaudii,the yellow represents up-regulation,the brown represents down-regulation and the gray represents false圖2 5種真菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenic analysis of Siderophore-iron transporters in 5 species

2.4 SIT基因表達(dá)分析

由表3可知，焦枯病菌侵染桉樹48 h后，CpSit1、CpSit3、CpSit5、CpSit8、CpSit9、CpSit10、CpSit11、CpSit14、CpSit15和CpSit16 10個基因上調(diào)表達(dá)。

表3 桉樹焦枯病菌SIT基因的相對轉(zhuǎn)錄表達(dá)量Table 3 Relative transcription levels of SIT genes in Calonectria pseudoreteaudii

結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析結(jié)果(圖2)可知，CpSit11和CpSit13聚在同一分支上，但是CpSit13表達(dá)不顯著，CpSit11上調(diào)且轉(zhuǎn)錄量較低；CpSit1和CpSit10，CpSit3、CpSit14和CpSit16，CpSit8和CpSit9，CpSit5和CpSit15分別聚在同一分支上，均為上調(diào)表達(dá)，且相對分支中其他基因具有較高的轉(zhuǎn)錄量。推測CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16 5個基因在焦枯病菌侵染桉樹的過程中具有較為重要的作用，CpSit3、CpSit9、CpSit10、CpSit11和CpSit15基因的作用可能相對較弱。CpSit2和CpSit4 2個基因下調(diào)表達(dá)，推測其可能在焦枯病菌侵染桉樹的過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。CpSit6、CpSit7、CpSit12和CpSit13 4個基因表達(dá)不顯著，說明這4個基因在焦枯病菌侵染桉樹過程中作用較弱，或在所研究的范圍之外發(fā)揮其他作用。

為了驗證上述基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，利用實時定量PCR對其中10個SIT基因進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。圖3顯示qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組的一致性較高，CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16均具有較高的表達(dá)量，且CpSit2和CpSit4均下調(diào)表達(dá)。轉(zhuǎn)錄分析表明，CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16基因可能在焦枯病菌侵染桉樹48 h時發(fā)揮著較為重要的作用。

圖3 10個SIT基因相對轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的比較Fig.3 Comparison of the relative expressions of SIT genes in Calonectria pseudoreteaudii

3 討論與結(jié)論

隨著病原真菌基因組測序工作的深入開展，越來越多的SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白獲得鑒定，但是其在林木病原真菌中的鑒定尚無相關(guān)報道。為弄清SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在焦枯病菌侵染桉樹過程中所起的作用，本研究對桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行鑒定和比較，并對其結(jié)構(gòu)域、跨膜螺旋、進(jìn)化關(guān)系和基因表達(dá)等進(jìn)行了分析，結(jié)果表明桉樹焦枯病菌共含有16個SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分別是13個鐵-鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、2個鐵載體-鐵:H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和1個鐵載體-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。桉樹焦枯病菌SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)域、跨膜螺旋數(shù)與典型SIT蛋白的一致性較高，其跨膜螺旋折疊方式為典型的MFS折疊。由于SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)的保守性，其可能具有相類似的功能和活性。

作為微生物鐵元素的攝入途徑之一，鐵載體-鐵化合物轉(zhuǎn)運(yùn)途徑對微生物的生長發(fā)育起著重要作用。如玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)鐵載體合成基因NPS6的突變體在鐵饑餓生境下生長幾乎受到完全抑制，說明玉米大斑病菌的鐵載體-鐵化合物的吸收與其生長發(fā)育密切相關(guān)[21]。除此之外，鐵載體-鐵化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)還與病原真菌的致病性有關(guān)。Hof等[22]研究表明，稻瘟菌鐵載體合成酶基因SSM1被敲除后，其致病性明顯減弱；Oide等[23]研究表明，玉米小斑病(Cochliobolusheterostrophus)的鐵載體合成基因NPS6獲得敲除后致病力減弱。但SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為鐵載體-鐵化合物的運(yùn)輸途徑，與其致病性是否存在關(guān)聯(lián)尚未明確。有研究表明，輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)FIR1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在低鐵條件下上調(diào)表達(dá)，但與其致病性不存在關(guān)聯(lián)[24]。然而，蘋果腐爛病菌(Valsamali)共含有7個SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中3個在蘋果腐爛病菌侵染蘋果樹的過程中發(fā)生上調(diào)[25]。為了解桉樹焦枯病菌是否與其致病性存在關(guān)聯(lián)，本研究基于焦枯病菌侵染桉樹48 h轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)譜，對16個SIT基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中10個基因上調(diào)表達(dá)、2個下調(diào)表達(dá)、4個表達(dá)不顯著。通過系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析發(fā)現(xiàn)，雖然部分焦枯病菌SIT基因聚集在同一分支上，但其表達(dá)量存在較為明顯的差異。其中，CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16相對分支中的其他基因具有較高的轉(zhuǎn)錄量，由此推測CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16等5個基因在焦枯病菌侵染桉樹的過程中發(fā)揮著較為重要的作用，其余基因的作用可能相對較弱，或在所研究的范圍之外發(fā)揮其他作用。為驗證基因表達(dá)譜的準(zhǔn)確性，本研究通過qPCR對其中10個SIT基因進(jìn)行驗證，與基因表達(dá)譜具有較高的一致性，其中CpSit1、CpSit5、CpSit8、CpSit14和CpSit16等5個基因均有較高的表達(dá)量。

綜上所述，SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白很可能與桉樹焦枯病菌基因的致病性密切相關(guān)。由于鐵元素攝取的重要性，后續(xù)可將SIT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為毒力因子，通過基因敲除等分子生物學(xué)手段對其功能進(jìn)行驗證，了解其在相應(yīng)生物學(xué)過程中的具體作用，為抗焦枯病菌藥物的研制提供靶標(biāo)基因。