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(哈爾濱商業(yè)大學(xué),食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

隨著人們生活質(zhì)量的上升,高血壓、高血脂癥等這些營養(yǎng)性疾病的發(fā)生率也在呈上升趨勢[1-2],成為威脅人類生命健康的主要疾病[3]。調(diào)節(jié)方法有很多,例如運(yùn)動鍛煉、控制飲食和服用貝特類、煙酸類藥物等,但是藥物都有毒副作用[4],因此,找到更為健康的治療高血脂癥的物質(zhì)成為研究的新熱點(diǎn)。

近些年對于植物多糖的研究較多,研究表明多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗癌、抗菌、防輻射以及降糖脂等生理活性[5-8],于美匯、趙鑫等[9]采用堿法提取黑木耳多糖,并且研究了其體內(nèi)外降血脂作用,結(jié)果表明黑木耳多糖具有降血脂作用。毛貴元[10]采用水提醇沉法提取紅雪茶多糖,研究表明紅雪茶粗多糖劑量在0.3 g·kg-1·d-1具有明顯的降脂保肝作用[11]。

紅樹莓(RubusidaevslL.)屬于薔薇科懸鉤子屬,又俗稱托盤、懸鉤子等[12],紅樹莓其果汁豐富,富含多種維生素和礦物質(zhì),含有多糖、黃酮類、SOD、鞣花酸等活性物質(zhì)[13-14],廣泛分布在溫帶地區(qū)的歐洲[15],樹莓因其豐富的營養(yǎng)價值而受人們喜愛[16]。目前,國內(nèi)外對于紅樹莓的研究為多酚、鞣花酸和花色苷等,而對于紅樹莓多糖的研究相對較少,Yu等[17]采用復(fù)合酶法提取紅樹莓多糖研究了生物活性。楊永晶等[18]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法測定樹莓多糖中單糖組成成分,確定樹莓多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成。目前,紅樹莓多糖對降血脂作用的研究未見報道,因此本文以紅樹莓為原料,提取并純化多糖,研究其降血脂作用,為紅樹莓多糖的降血脂功效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6月份新鮮采摘的紅樹莓鮮果 尚志市帽兒山果園;清潔級Wistar雄性大鼠(200±5) g、生產(chǎn)許可編號:Scxk(Ji)-2011-000、合格證編號:201500010264) 長春億斯動物中心;濃硫酸 天津渤?；す煞萦邢薰?分析純;苯酚 天津渤?；す煞萦邢薰?分析純;果膠酶(8911±145.93) U/g 北京博奧拓達(dá)科技有限公司,分析純;纖維素酶(9692±101.13) U/g 北京博奧拓達(dá)科技有限公司,分析純;葡萄糖 天津石英鐘廠霸州市化工分廠,分析純;DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephadex G-100 Whatman公司;膽固醇 上?；菔郎噭┯邢薰?分析純;豬膽鹽 北京奧博星生物試劑有限責(zé)任公司,分析純;豬油 自制;基礎(chǔ)飼料 長春億斯動物中心。

TU-1900型紫外可見分光亮度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;MC型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;FW177型中草藥粉碎機(jī) 上海思爾達(dá)科學(xué)儀器有限公司;ZDF-6090型真空干燥箱 上海恒一科學(xué)儀器有限公司;SR-A10N-50冷凍干燥機(jī) 上海舍巖儀器有限公司;色譜柱 沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅樹莓多糖制備 準(zhǔn)確稱取一定量的紅樹莓,洗凈后擺放在干凈的托盤中,在55 ℃低溫條件下進(jìn)行烘干處理,粉碎,過80目篩。采用復(fù)合酶法提取紅樹莓多糖[19]。按料液比1∶30 g/mL、添加復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶=1∶2)1.5%和pH4.0條件下,30 ℃水浴鍋中酶解25 min,滅酶并過濾(100 ℃,10 min),濾液為紅樹莓多糖粗提液[20],旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積1/4后冷凍干燥(最低冷卻溫度-60 ℃、壓力為0.001 mBar),分別過DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析和葡聚糖凝膠柱層析,收集主峰,蒸發(fā)濃縮,冷凍干燥,得到分離純化后的紅樹莓多糖,進(jìn)行分子量測定和單糖組成分析[21]。

1.2.2 多糖含量測定

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 配制濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖溶液,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于比色管中,加入蒸餾水至2.0 mL,各加入6%苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速加入5.0 mL濃硫酸,靜置10 min后搖勻于室溫下放置20 min,于490 nm測定吸光度A[22]。將葡萄糖的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]。

1.2.2.2 紅樹莓多糖含量的測定 準(zhǔn)確移取1.0 mL紅樹莓多糖提取液,按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法測定其多糖含量,計算多糖得率。

式(1)

式中:X為多糖得率,%;c為測量濃度,μg/mL;n為稀釋倍數(shù);V為提取液體積,mL;m為原料干重,g;0.934為紅樹莓總糖換算成多糖系數(shù)。

1.2.3 紅樹莓多糖分子量測定 采用高效液相凝膠色譜法測定紅樹莓多糖分子量。色譜條件如下:色譜柱為水溶性凝膠柱 120+水溶性凝膠柱 250+水溶性凝膠柱 2000;流動相為超純水;流速為0.6 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為20 μL;檢測器為Waters 2414示差折光檢測器,將紅樹莓多糖配制成3 mg/mL的溶液,8000 r/min離心10 min,取上清液過0.45 μm微濾膜,進(jìn)樣20 μL[24]。取不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖配成2%的溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)分別是標(biāo)準(zhǔn)多糖分子量的對數(shù)值(Lg)、保留時間,計算樣品分子量[25]。

1.2.4 紅樹莓多糖單糖組成分析 采用氣相色譜法對紅樹莓多糖的單糖組成進(jìn)行分析。色譜條件如下:檢測器為FID;載氣和流速為N2、流速為2 mL/min、空氣流速為550 mL/min;流速為0.6 mL/min;氣化室柱溫250 ℃、檢測器柱溫250 ℃;程序升溫:180 ℃(5 min)-240 ℃(25 min),3 ℃/min;進(jìn)樣量0.8 μL[25]。標(biāo)準(zhǔn)品順序?yàn)槭罄钐恰r藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。取多糖樣品10 mg,2 mol/L三氟乙酸加1 mL,120 ℃水解3 h,水解液4000 r/min離心10 min,加2 mL甲醇,反復(fù)蒸干。再加入2 mL雙蒸水、30 mg硼氫化鈉,還原3 h,用冰醋酸中和,減壓蒸干,多次加甲醇5 mL,110 ℃烘干,然后各加入乙酸酐、吡啶0.5 mL,100 ℃下保溫1 h,冷卻后,加入甲苯3 mL,重復(fù)多次蒸干,再加入3 mL三氯甲烷,雙蒸水反復(fù)洗滌3此后,倒掉上層水溶液,加入無水硫酸鈉,過0.22 μm微濾膜,進(jìn)行氣相色譜分析[24-25]。

1.2.5 紅樹莓多糖降血脂作用研究

1.2.5.1 高脂飼料配方 大鼠的高脂飼料配方:78.8%基礎(chǔ)飼料,10%蛋黃粉,10%豬油,0.2%豬膽鹽,1%膽固醇[26]。

1.2.5.2 動物模型建立與分組 Wista雄性大鼠,進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,禁食12 h并按照每組10只隨機(jī)分成5組,分別為正常對照組(Normal control,NC)、陽性對照組(Positive control,PC)、紅樹莓多糖低劑量組(Low control,LC)、紅樹莓多糖中劑量組(Mid control,MC)、紅樹莓多糖高劑量組(High control,HC)[27]。正常組喂食基礎(chǔ)飼料,其他四組均喂食高脂飼料。成功建立高脂模型后,對大鼠的飲水和禁食不加限制,21 d后禁食過夜(12 h),次日采血[28]。

1.2.5.3 高血脂癥大鼠的降血脂實(shí)驗(yàn) 選取建模成功的大鼠,設(shè)定合適的劑量,給大鼠進(jìn)行灌胃[29]。具體灌胃劑量如表1。

表1 高血脂癥模型大鼠分組Table 1 The group of hyperlipidemia rats

1.2.5.4 動物模型體質(zhì)量的測定 分別于0、7、14、21 d對大鼠體重進(jìn)行跟蹤測定,觀察紅樹莓多糖對降血脂模型大鼠體質(zhì)量的影響[30]。

1.2.5.5 高血脂癥大鼠血脂指標(biāo)的測定 大鼠連續(xù)灌胃21 d后,禁食過夜12 h,眼眶取血10 mL,用3000 r/min離心10 min,將分離出的血清,-20 ℃冰箱冷凍保存。用全自動生化分析儀,分別來測定血清中四項(xiàng)指標(biāo)TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)、LDL-C(低密度脂蛋白)和HDL-C(高密度脂蛋白)的含量[27,31]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果與分析

如圖1可知,在490 nm下測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光值之間的回歸方程為:y=0.0146x+0.0021,R2=0.9997。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 RRP-I分子量測定結(jié)果與分析

根據(jù)圖3可知,RRP-I的出峰時間為7.829 min,將其帶入回歸方程(圖2)中,計算得出RRP-I的分子量為11220.1845 Da。

圖2 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Dextran standard curve

圖3 RRP-I的高效液相凝膠色譜圖Fig.3 RRP-I high performance gel liquid chromatography

2.3 RRP-I單糖組成結(jié)果與分析

標(biāo)準(zhǔn)品順序依次為鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比可知,RRP-I組成為葡萄糖。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)單糖和RRP-I GC圖譜Fig.4 Standard monosaccharide and RRP-I gas chromatography注：a：標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖；b:RRP-I。

2.4 紅樹莓多糖降血脂作用的結(jié)果與分析

2.4.1 大鼠體質(zhì)量測定結(jié)果與分析 如表2可知,在第0 d各組之間的體重趨于平衡,無明顯漲幅。經(jīng)口灌胃7 d,各組體重呈現(xiàn)上升趨勢,其中NC組和DC組顯示持續(xù)生長且高于相同時間段治療組的體重。DC組的大鼠體重與NC組相比具有顯著性(p<0.05)。HD、MD、LD組的大鼠體重與NC組相比具有顯著性(p<0.0001);HD、MD、LD組的大鼠體重與DC組相比顯著(p<0.05),DC體質(zhì)量高于其它組,并且在21 d后與NC組體質(zhì)量極顯著(p<0.0001)。RRP-I劑量組對大鼠體重增加有一定的改善作用,且呈現(xiàn)劑量性依賴。

表2 RRP-I對大鼠體重的影響(g)Table2 Effects of RRP-I on body weight in rats(g)

2.4.2 紅樹莓多糖對高血脂癥大鼠血脂水平影響的結(jié)果與分析

2.4.2.1 紅樹莓多糖對高血脂癥大鼠TC水平影響的結(jié)果與分析 由圖5可見,DC組大鼠血清中的TC水平與NC組相比極顯著(p<0.0001)升高,證明高血脂癥大鼠造模成功。HD、MD和LD組大鼠血清中的TC水平與NC組相比顯著升高,HD、MD和LD組大鼠血清中的TC水平顯著低于DC組,張海華[27]、付瑩[28]、寧娜[29]等已經(jīng)證實(shí)這個變化水平,血清TC水平增高,可使高血脂的發(fā)病率明顯升高,RRP-I高、中、低劑量可以顯著降低血清TC水平,實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)可以起到改善高血脂癥的作用。

圖5 RRP-I對大鼠TC水平的影響Fig.5 Effects of RRP-I on TC level in rats注：a:p<0.05,A:p<0.0001與NC組比較; b:p<0.05,B:p<0.0001與DC組比較；圖6～圖8同。

2.4.2.2 紅樹莓多糖對高血脂癥大鼠TG水平影響的結(jié)果與分析 由圖6可見,DC組大鼠血清中的TG水平顯著高于NC組,證明高血脂癥大鼠造模成功。HD、MD和LD組大鼠血清中的TG水平與NC組相比顯著升高,HD、MD和LD組大鼠血清中的TG水平顯著低于DC組(p<0.05),表明高脂血癥的TG水平可以被RRP-I高、中、低劑量降低,實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)可以起到改善高血脂癥的作用。

圖6 RRP-I對大鼠TG水平的影響Fig.6 Effects of RRP-I on TG level in rats

2.4.2.3 紅樹莓多糖對高血脂癥大鼠LDL-C水平影響的結(jié)果與分析 由圖7可見,DC組大鼠血清中的LDL-C水平與NC組相比顯著升高(p<0.05),證明高血脂癥大鼠造模成功。HD、MD和LD組大鼠血清中的LDL-C水平與NC組相比顯著升高(p<0.0001),HD、MD和LD組與DC組相比大鼠血清中的LDL-C水平顯著降低,表明RRP-I高、中、低劑量可以顯著降低高脂血癥的LDL-C水平,實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)可以起到改善高血脂癥的作用。

圖7 RRP-I對大鼠LDL-C水平的影響Fig.7 Effects of RRP-I on LDL-C level in rats

2.4.2.4 紅樹莓多糖對高血脂癥大鼠HDL-C水平影響的結(jié)果與分析 由圖8可見,DC組大鼠血清中的HDL-C水平顯著低于NC組(p<0.05),證明高血脂癥大鼠造模成功。HD、MD和LD組大鼠血清中的HDL-C水平與NC組相比顯著升高,HD、MD和LD組大鼠血清中的HDL-C水平顯著比DC組高,HDL-C可以抗動脈粥樣硬化,RRP-I高、中、低劑量可以顯著升高高脂血癥的HDL-C水平,實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)可以起到改善高血脂癥的作用。

圖8 RRP-I對大鼠HDL-C水平的影響Fig.8 Effects of RRP-I on HDL-C level in rats

3 結(jié)論

采用復(fù)合酶法提取紅樹莓多糖,并將純化后得到的紅樹莓多糖,通過動物實(shí)驗(yàn)的方法對紅樹莓多糖進(jìn)行降血脂作用的研究。結(jié)果顯示RRP-I分子量為11220.1845 Da,單糖組成為由葡萄糖組成的均一多糖。模型在灌胃RRP-I 21d時,高中低劑量組對高脂大鼠的體重增加均有一定的改善作用,且呈現(xiàn)劑量性依賴。對患有高血脂癥的大鼠有一定的治療效果,血脂四項(xiàng)的檢測結(jié)果按照正常的變化趨勢變化,TC、TG和LDL-C水平降低,HDL-C水平升高,HD組表現(xiàn)出最好的效果,說明RRP-I可以改善高血脂癥大鼠的血脂水平。本文為將研究紅樹莓多糖降血脂藥物提供理論依據(jù)。