福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

近年來，中醫(yī)藥備受關(guān)注，根據(jù)國家有關(guān)政策，食藥兩用果樹的綠色發(fā)展已被定為發(fā)展目標(biāo)和重點(diǎn)扶持方向。提高食藥兩用中藥材的用途和利用價(jià)值，根據(jù)中醫(yī)藥理論配伍，生產(chǎn)能促進(jìn)人體健康且又具有高附加值的功能果品產(chǎn)品，對(duì)改善人們生活習(xí)慣，提高生活質(zhì)量具有重要意義。咳嗽是一種臨床常見病證，中醫(yī)病機(jī)是由風(fēng)邪犯肺，肺宣發(fā)肅降功能受郁，進(jìn)而肺氣上逆之證。隨著人們對(duì)咳嗽病因、病機(jī)及治療方法認(rèn)識(shí)的逐漸深入，人們更重視環(huán)境因素、鼻、咽喉疾病所致的病因[1]。針對(duì)干燥環(huán)境特別是空調(diào)環(huán)境下引起的咽喉疾病所致咳嗽，課題組經(jīng)過民間調(diào)查及臨床實(shí)踐，總結(jié)以烏梅為君，青果(橄欖)、橘皮為臣，粳米、茶為佐使，組成青梅復(fù)方治療燥熱咳嗽、咽喉疼痛等具有一定療效。青果、烏梅作為我國天然的藥食兩用物品，具有獨(dú)特的功效和很好的營養(yǎng)保健價(jià)值。兩者更多用于副食品，而用于鎮(zhèn)咳祛痰產(chǎn)品開發(fā)甚少[2]。因此課題組取青梅復(fù)方之利咽止咳功效，開發(fā)防治“空調(diào)病”所造成的咳嗽口干，咽喉干燥等問題的功能性飲料，通過正交試驗(yàn)對(duì)配方進(jìn)行優(yōu)選，并對(duì)添加的穩(wěn)定劑進(jìn)行考察；對(duì)飲料中的固體含量和保存過程中致病菌產(chǎn)生情況等進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并采用沒食子酸[3]以及橙皮苷[4]為指標(biāo)利用高效液相色譜對(duì)飲料主要成分進(jìn)行定性分析，研究復(fù)方青梅飲料的制作工藝。

1 儀器與材料

1.1 儀器 WYT-32手持糖量計(jì)(泉州光學(xué)儀器廠)、HH-501超級(jí)恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、LXJ-IIB低速多管離心機(jī)(上海安亭儀器廠)、LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)、RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、DLSB-5120低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、AR2140電子平臺(tái)(梅特勒·托利多儀器有限公司)、A10超純水(美國Millipore-Q公司)等。

1.2 試劑 碳酸氫鈉(食品級(jí)，青島優(yōu)索化學(xué)科技有限公司)、海藻酸鈉(食品級(jí)，鄭州祥瑞生物科技有限公司)、羧甲基纖維素鈉(CMC)(食品級(jí)，江陰市恒達(dá)化工有限公司)、苯甲酸鈉(食品級(jí)，滕州市藤寶化工有限公司)、卡拉膠(批號(hào)：2016011217，滕州市香凝生物工程有限公司)、果膠酶(批號(hào)：16070409，南寧龐博生物工程有限公司)、月桂基硫酸鹽胰蛋白肉湯(批號(hào)：20160303，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、瓊脂培養(yǎng)基(CMO325，英國OXOID公司)、烏梅(批號(hào)：20170902，福建省永泰縣永豐果子廠)、青果(批號(hào)：20171022，福建青橄欖銷售有限公司)、橘皮(批號(hào)：20160109，福建尤溪仙錦藥業(yè)有限公司)、小米(批號(hào)：20170805，江蘇淮安禾香源米廠)、茶葉(批號(hào)：20171106，福建省安溪縣升美茶業(yè)有限公司)、甲酸(批號(hào)：20171204，上海展云化工有限公司)、甲醇(批號(hào)：20170605，上海展云化工有限公司)。

2 工藝研究方法與結(jié)果

2.1 制備青果提取液

2.1.1 青果原料選擇 青果要求為無病蟲害無霉變、無腐爛的新鮮果實(shí)，大小均勻，除去枝葉等雜物。

2.1.2 熱燙 取洗凈之后的青果按1∶6的料液比，同時(shí)加入含有所制備青果汁體積的0.1%的碳酸氫鈉的沸水中熱燙30 min，去除表皮蠟質(zhì)層，使果肉組織軟化。

2.1.3 破碎榨汁 通過手工去核，再將熱燙的殘留液與去核之后的果肉混合榨汁，重復(fù)三次保證充分榨汁。

2.1.4 酶解 將破碎榨汁之后的汁液中加入0.1%的果膠酶，并在55 ℃水中水浴處理4 h，其間每隔一小時(shí)充分?jǐn)嚢枰淮巍?/p>

2.1.5 過濾 將酶解后的果汁用5000 r·min-1的離心機(jī)離心10 min，取上層澄清的青果提取液備用[5]。

2.2 制備烏梅提取液 烏梅∶水按1∶6料水比例，在95 ℃浸提30 min，冷卻去核打漿制得粗漿液，用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速為5000 r·min-1，時(shí)間為10 min下離心后過濾，取上層澄清的烏梅提取液備用[6-7]。

2.3 制備小米提取液

2.3.1 挑揀、清洗；

2.3.2 蒸煮 取陳米按照1∶20的比例，蒸煮30 min，使米淀粉充分糊化，破壞淀粉顆粒，舒展淀粉分子。

2.3.3 打漿 利用打漿機(jī)打漿得到粗米汁。

2.3.4 分離 采用低速離心分離將小米提取液與米渣分離，轉(zhuǎn)速：5000 r·min-1，時(shí)間：10 min。

2.4 制備橘皮提取液 取干凈無霉變橘皮，粉碎，按照料液比1∶20 g·mL-1(質(zhì)量體積比)，蒸煮15 min。用200目紗布過濾，得濾液備用[8]。

2.5 制備茶提取液

2.5.1 選料 茶葉精選時(shí)需滿足優(yōu)質(zhì)、具有香氣、無發(fā)霉現(xiàn)象等條件。

2.5.2 浸提 加90 ℃水浸泡茶葉，將茶杯置于90 ℃恒溫水浴箱中，浸泡時(shí)間5 min，茶水比為1∶20，使茶葉中有效保健成分充分浸出。

2.5.3 過濾 用100目的濾布濾出茶提取液，茶葉放回杯中備用。濾得的茶提取液呈亮黃色[9]。

2.6 工藝正交試驗(yàn) 選取飲料的主要成分青果、烏梅、橘皮、小米、茶葉以及糖這六個(gè)因素設(shè)計(jì)工藝的三水平的L18(36)正交試驗(yàn)因素水平表，見表1。調(diào)配后的飲料由20名不同年齡層的食品專業(yè)人員根據(jù)口感、顏色、香氣等感官綜合評(píng)定，見表2。

表1 復(fù)方青梅飲料正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) (%)

表2 復(fù)合汁感官評(píng)價(jià)參考標(biāo)準(zhǔn)表[10]

2.7 工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 由表3、4可知，影響最佳配方工藝的因素主次順序?yàn)椋築>F>D>C>E>A，即烏梅>糖>茶>橘皮>小米>青果。通過方差分析，青果(A)、烏梅(B)、橘皮(C)、茶(D)、小米(E)、糖(F)對(duì)配方工藝的影響均達(dá)到顯著性水平(P<0.05)，配方工藝的最佳工藝條件是：A3B1C3D2E1F3，即青果提取液24%，烏梅提取液3%，橘皮提取液14%，小米提取液10%，茶提取液8%，糖3%。

表3 復(fù)方青梅飲料的正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

表3 復(fù)方青梅飲料的正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 工藝實(shí)驗(yàn)方差分析表

2.8 不同穩(wěn)定劑對(duì)飲料的影響研究[11]參考文獻(xiàn)記載，分別以濃度0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的CMC、海藻酸鈉、卡拉膠、黃原膠、結(jié)冷膠分別取1 mL加入到100 mL混合提取液進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，放置于4 ℃的冰箱中7 d，觀察沉淀產(chǎn)生情況。7 d作用后，發(fā)現(xiàn)卡拉膠、海藻酸鈉、CMC三者在加入量為1%時(shí)能使混合提取液中的不穩(wěn)定的蛋白等物質(zhì)快速沉淀下來，而濃度為0.1%的CMC、卡拉膠、海藻酸鈉、添加量為1%加入至混合提取液中，在4 ℃冰箱中放置7 d后，取上清液，即得飲料，該飲料口感較佳，色澤均勻澄清，具有原料特有的風(fēng)味與香氣，故此以濃度為0.1%的CMC、卡拉膠、海藻酸鈉，加入量為1%添加入飲料的方式可達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

2.9 復(fù)方青梅飲料的制備方法 將上述5種提取液混合，獲得均勻一致的飲料，放置過夜，用200目紗布粗濾，得到澄清混合液，加入CMC、卡拉膠、海藻酸鈉在4 ℃的冰箱中放置7 d，7 d后在5000 r·min-1的離心機(jī)下離心10 min，取上清液，加入0.1%苯甲酸鈉，即可。

2.10 滅菌 將飲料密封，滅菌溫度和時(shí)間如表5所示，放置于立式壓力蒸汽滅菌機(jī)滅菌。結(jié)果表明：滅菌后，第2組口味最佳，故滅菌方法采用105 ℃條件下滅菌8 min。

表5 不用滅菌條件對(duì)復(fù)方飲料口味的影響

3 復(fù)方青梅飲料的質(zhì)量研究

3.1 可溶性固體物含量測(cè)定 根據(jù)GB/T 12143《飲料通用分析方法》采用折光儀法測(cè)定：打開手持式折光儀蓋板，用干凈的紗或卷紙小心擦干棱鏡玻璃面。在棱鏡玻璃面上滴2滴蒸餾水，蓋上蓋板。于水平狀態(tài)，旋動(dòng)刻度調(diào)節(jié)螺旋，使分界線面剛好落在零線上。打開蓋板，用紗布或卷紙將水擦干，如上法在棱鏡玻璃面上滴2滴滅菌后復(fù)合汁進(jìn)行觀測(cè)，讀取視野中明暗交界線上的刻度，即為成品中可溶性固形物含量(%)，重復(fù)三次。

分別測(cè)得可溶性固體含量為1.05%、0.95%、1.05%，取三次平均值即得復(fù)方飲料中可溶性固體含量為1.02%。

3.2 微生物檢測(cè)

3.2.1 大腸菌群MPN值的測(cè)定 對(duì)每個(gè)樣品，選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(LST)肉湯，每管接種1 mL。并將接種管置于(36±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(48±2)h。結(jié)果均未出現(xiàn)氣泡，說明該飲料中不存在大腸桿菌。

3.2.2 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)(平板菌落計(jì)數(shù)法) 對(duì)每個(gè)樣品,選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，同時(shí)取1 mL稀釋液加入一個(gè)無菌平皿作為空白對(duì)照。及時(shí)將15 mL～20 mL冷卻至46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并水平放置平板使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，(36±1) ℃培養(yǎng)(48±2)h。后用肉眼觀察計(jì)數(shù)菌落[12]，每個(gè)平皿觀察計(jì)數(shù)3次，最終結(jié)果該稀釋度兩個(gè)無菌平皿內(nèi)菌落數(shù)平均值(即每個(gè)稀釋度取六次觀察結(jié)果之均值)。結(jié)果菌落總數(shù)為36 CFU/mL，未檢出致病菌，達(dá)到安全級(jí)別。

3.3 飲料成分定性分析

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制 精密稱定2.500 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成濃度為0.25 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，備用。精密稱取2.500 mg橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成濃度為0.25 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，備用。

3.3.2 供試品的配制 取配制好的復(fù)方青梅飲料500 mL，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮成浸膏，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，定容，搖勻，備用。

3.3.3 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS 25 μm(4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相：溶劑C(甲醇)和溶劑D(0.1%甲酸)，梯度洗脫：(0.01～8 min，C：8%→17%，D：95%→ 83%；8～15 min，C：17%→ 45%，D：83%→ 55%；15～25 min，C：45%～45%，D：55%～55%；25～27 min，C：45%～8%，D：55%～92%；27～37 min，C：8%～8%，D：92%～92%)，流速：1.00 ml·min-1，檢測(cè)波長：283 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL[13]。

3.3.4 色譜結(jié)果與分析 在所設(shè)的色譜條件下，沒食子酸的保留時(shí)間為6.89 min，橙皮苷的保留時(shí)間為22.12 min，飲料中的沒食子酸和橙皮苷能夠有效分離，其他成分沒有存在干擾。結(jié)果表明:復(fù)方青梅飲料中含有青果的主要成分沒食子酸以及橘皮的主要成分橙皮苷。

4 討論

隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥的發(fā)展以及人們對(duì)中醫(yī)藥更加廣泛的認(rèn)可，將食藥兩用的中藥材進(jìn)一步開發(fā)逐漸成為一種趨勢(shì)。青果、烏梅等食藥兩用中藥材在福建地區(qū)大量種植，產(chǎn)量高，但針對(duì)其本身附加值不高等問題，課題組在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)青果具有防醉，解酒，保肝護(hù)肝、保護(hù)胃腸道黏膜、解豚魚中毒、抗乙肝病毒、利咽止咳、抗菌等作用[14]，烏梅具有鎮(zhèn)咳、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗驚厥、抑制黑色素、抑制腎結(jié)石形成、止血、抗氧化、抗病毒等作用[15]，明確了青果、烏梅具有利咽止咳功效，通過臨床實(shí)踐總結(jié)的青梅復(fù)方對(duì)因空調(diào)病造成的咳嗽口干，咽喉干燥等癥狀具有一定的治療作用，將其開發(fā)為功能性飲料提升了青果、烏梅等中藥材的附加值，同時(shí)也具有一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

由于飲料制作應(yīng)注意其風(fēng)味口感，青梅復(fù)方中烏梅偏酸，因此期望調(diào)整成分比例在不影響其功效情況下達(dá)到較好的口感，故實(shí)驗(yàn)中采用正交試驗(yàn)方法對(duì)原料比例進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳配方為:青果提取液24%，烏梅提取液3%，橘皮提取液14%，小米提取液10%，茶提取液8%，糖3%。同時(shí)根據(jù)前期研究結(jié)果表明該復(fù)方中含有大分子蛋白，不利于飲料的長期保存，因此通過文獻(xiàn)研究，分別對(duì)CMC、海藻酸鈉、卡拉膠、黃原膠、結(jié)冷膠進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以CMC、海藻酸鈉、卡拉膠做為穩(wěn)定劑效果較好，由此組成復(fù)合添加劑：0.1%CMC、0.1%卡拉膠、0.1%海藻酸鈉，加入量為1%。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)10789-2007《飲料通則》的規(guī)定，采取平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)飲料中的固體含量以及微生物等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該飲料中不存在大腸桿菌，且細(xì)菌總數(shù)為36 CFU，達(dá)到安全級(jí)別。通過正交試驗(yàn)的方法得出的最佳配方比例，具有原料特有的風(fēng)味、色澤鮮艷、均勻，以及后期以《飲料通則》為標(biāo)準(zhǔn)的一系列指標(biāo)檢測(cè)均符合國家之標(biāo)準(zhǔn)。

基于飲料主要成分青果、橘皮等經(jīng)過沉淀、離心、高溫消毒并在正交試驗(yàn)優(yōu)化配方比例之后其主要成分的功能性成分是否存在的問題。課題組以青果、橘皮主要成分沒食子酸和橙皮苷為檢測(cè)對(duì)象，采用高效液相色譜法進(jìn)行定性分析，結(jié)果在色譜圖中可明顯看出復(fù)方飲料中含有沒食子酸以及橙皮苷。高效液相色譜法在測(cè)定飲料中是否存在沒食子酸以及橙皮苷等主要成分時(shí)，具有靈敏度高、精確度高等優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)圖譜直觀明了得出結(jié)論。但相對(duì)于定性分析常用的薄層色譜法以及化學(xué)反應(yīng)等方法而言，高效液相色譜法更加復(fù)雜，可以以實(shí)際情況選擇方法。

復(fù)方青梅飲料應(yīng)用青果、烏梅、橘皮、小米、茶五種原料，經(jīng)配伍，合理加工而得產(chǎn)品為色澤鮮艷、氣味清新的綠色健康的功能性飲料。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)得出：青果的最佳提取工藝為1∶6的料液比，在55 ℃條件下水浴提取4 h；烏梅的最佳工藝為1∶6的料液比，在95 ℃條件下水浴提取30 min；橘皮的最佳工藝為1∶20的料液比，蒸煮15 min；小米的最佳工藝為1∶20的料液比，蒸煮30 min；茶的最佳提取工藝為1∶20的料液比，在90 ℃條件下水浴提取5 min。復(fù)方青梅飲料穩(wěn)定劑為0.1% CMC、海藻酸鈉、卡拉膠，添加量為1%。最佳配方為:青果提取液24%，烏梅提取液3%，橘皮提取液14%，小米提取液10%，茶提取液8%，糖3%，高溫滅菌條件為105 ℃條件下滅菌8 min。以此做出的復(fù)方青梅飲料，工藝操作簡(jiǎn)單，在較低溫度下即可提取，酸甜適中，均勻一致，具有青果，烏梅，橘皮的天然風(fēng)味，可為開發(fā)中藥保健飲料提供一定的參考價(jià)值。