楊少華 黃艷艷 張琳 黃慶華 崔寧 張秀美 許傳田

摘要：為探討新城疫病毒（NDV） P基因及其編碼蛋白的遺傳進化特性，了解野鳥源NDV的基因變異情況，本研究對我國首次分離的野鳥源Ⅰ類NDV分離株SD18/13的P基因進行了測序，并從GenBank中選取不同基因型毒株的P基因序列進行遺傳進化分析。結(jié)果表明，SD18/13 P基因開放閱讀框全長1 200 bp，編碼399個氨基酸，與Ⅰ類NDV的氨基酸同源性為83.5%～98.5%，與Ⅱ類NDV的氨基酸同源性為67.2%～70.5%。SD18/13與法國分離株Teal/France/10010/2010聚于一簇，同屬于基因10型Ⅰ類NDV，兩者P基因的核苷酸同源性為98.2%，氨基酸同源性為98.5%。

關(guān)鍵詞：新城疫病毒；P基因；克隆測序

中圖分類號：S852.65+7 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）09-0126-04

Abstract In order to investigate the genetic evolution characteristics and its encoded protein of phosphoprotein （P） gene of Newcastle disease virus （NDV）， and to understand the genetic variation of NDV in wild birds， the P gene of SD18/13 firstly isolated from wild type bird NDV in China was sequenced. The P gene sequences of different genotypes were selected from GenBank， and genetic evolution analysis was carried out. The results showed that P gene of SD18/13 was 1 200 bp in length and contained an opening reading frame coding 399 amino acids. P gene of SD18/13 share 83.5%～98.5% amino acid homology with Class Ⅰ NDV， and 67.2%～70.5% amino acid homology with Class Ⅱ NDV. SD18/13 was clustered into sub-genotype 10 in Class Ⅰ NDV， and showed high similarity with French isolate Teal/France/10010/2010. The nucleotide homology of the P gene between SD18/13 and Teal/France/10010/2010 was 98.2% and the amino acid homology was 98.5%.

Keywords Newcastle disease virus （NDV）； P gene； Cloning and sequencing

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）引起的嚴重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的傳染病病原之一[1]，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的傳染病，我國農(nóng)業(yè)部將其列為一類動物疫病。NDV在分類上屬于副粘病毒科副粘病毒亞科禽腮腺炎病毒屬，為有囊膜、單股負鏈RNA病毒[2]，其基因組全長約15.2 kb，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L），以3′-NP-P-M-F-HN-L-5′的順序排列[3]。NDV只有一個血清型，但是可以分為不同的基因型，根據(jù)遺傳進化特性可將新城疫病毒分為2類，即Ⅰ類（ClassⅠ）和Ⅱ類（ClassⅡ），Ⅰ類新城疫病毒多為弱毒株，可分為1～10種基因型，Ⅱ類新城疫病毒可分為Ⅰ～ Ⅸ基因型[4，5]。NDV宿主非常廣泛，可感染多種鳥類和野生水禽，水禽是NDV的天然貯存宿主[6-8]。

P蛋白位于核衣殼內(nèi)，與L和NP蛋白形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein， RNP）復合物， 參與病毒的復制和轉(zhuǎn)錄。P蛋白是決定NDV毒力強弱和免疫原性的主要因子，在NDV種屬分類、基因進化及毒力因素方面也起到重要作用[9]。本研究對我國首次分離的基因10型Ⅰ類NDV分離株的P基因進行克隆和遺傳進化分析，并與國內(nèi)外一些代表性毒株進行同源性比對分析，以探討國內(nèi)外不同基因型P基因的差異，了解NDV基因的演化規(guī)律，以期為NDV的免疫預防提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株

2013年本實驗室在NDV流行病學調(diào)查中從白鷺上分離鑒定并保存的毒株，為基因10型Ⅰ類NDV分離株SD18/13[10]。

1.2 主要試劑

一步法RT-PCR試劑盒、膠回收試劑盒購自大連寶生物公司，Trizol 購自Invitrogen公司，T載體、DH5α感受態(tài)細胞購自北京全氏金公司。

1.3 P基因的克隆測序

利用Primer 5.0設(shè)計引物，P1：5′-ACGACACCGATTGGGGCT-3′，P2：5′-GTATGTGGTGATGAACACTGAG-3′，擴增片段為1.9 kb。Trizol法提取病毒RNA，按照試劑盒說明，采用一步法RT-PCR進行P基因的擴增。PCR反應體系為100 μL，包括：反應緩沖液10 μL ，MgCl2 （25 mmol）20 μL，dNTP（各10 mmol/L） 10 μL，AMV RTase 2 μL，AMV-Optimize Taq （5 U/μL）2 μL ，RNA酶抑制劑（5 U/μL）2 μL ，上下游引物（20 μmol）各2 μL ，RNA模板8 μL ，RNase free H2O補至100 μL 。PCR反應條件為：50℃ 15 min，94℃ 2 min；然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物純化后插入T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，鑒定陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測序。

1.4 P基因序列比對及遺傳進化分析

從GenBank選取NDV代表性毒株的序列，用DNAStar軟件對SD18/13和參考株P(guān)基因序列及其編碼的氨基酸序列進行比對和同源性比較，利用遺傳進化分析軟件MEGA 4.1以Neighbor-joining方法構(gòu)建新城疫病毒P基因系統(tǒng)進化樹，其中Bootstrap設(shè)置為1 000次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 P基因的擴增與測序

RT-PCR擴增產(chǎn)物約1.9 kb，與預期片段長度相符，測序發(fā)現(xiàn)SD18/13 P基因全長1 463 nt，ORF長度1 200 bp，編碼399個氨基酸。

2.2 P基因序列比對和遺傳進化分析

通過與GenBank中參考株序列比對，SD18/13 P基因與Class Ⅱ NDV的核苷酸同源性為63.9%～65.5%，氨基酸同源性為67.2%～70.5%，其中與疫苗株LaSota的氨基酸同源性為70.2%；與國內(nèi)強毒株F48E8的氨基酸同源性為70.5%；SD18/13 P基因與ClassⅠ毒株的核苷酸同源性為83.2%～98.2%，氨基酸同源性為83.5%～98.5%。利用MEGA 4.1軟件對P基因進行系統(tǒng)進化分析（圖1），結(jié)果表明，SD18/13 P基因與分離株Teal/France/10010/2010聚于一簇，同屬于ClassⅠ基因10型毒株，這與利用F基因進行遺傳進化分析的結(jié)果相符（圖略）。

2.3 P蛋白氨基酸變異位點分析

將SD18/13及參考株P(guān)蛋白氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)SD18/13 P蛋白氨基酸殘基變異位點較多，且某些位點的氨基酸是不同群不同基因型NDV所特有的。其中，ClassⅠ和ClassⅡ群特異性位點有34個；基因10型NDV的P蛋白存在數(shù)個區(qū)別于ClassⅠ其他基因型NDV的特征性氨基酸位點，如：G61A、S126N、H176P、P222Q等；而位點P299L、V342I、G372S是分離株SD18/13所特有的，與其他ClassⅠ和ClassⅡ參考毒株均不同（表1）。

3 討論與結(jié)論

P蛋白因絲氨酸和蘇氨酸含量較高，常作為磷酸化位點被宿主細胞內(nèi)蛋白激酶激活而發(fā)生磷酸化，故稱之為磷蛋白，P蛋白磷酸化在病毒RNA的合成中發(fā)揮重要作用[11]。P蛋白與L蛋白結(jié)合形成病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），再與NP蛋白包裹的RNA特異性結(jié)合，形成RNP復合物，繼而啟動病毒的復制。除此之外，P蛋白可阻止NP蛋白的“非法”衣殼化[12]。P蛋白上主要的功能區(qū)結(jié)構(gòu)域分別為：P-N蛋白結(jié)合區(qū)、P-P蛋白相互作用區(qū)、P-L蛋白的結(jié)合區(qū)。P-N蛋白結(jié)合區(qū)，位于P蛋白的N端（PNT），P-P蛋白相互作用區(qū)和P-L蛋白的結(jié)合區(qū)位于P蛋白的C端[13，14]。P蛋白N端1～59位氨基酸和C端316～347位氨基酸能形成超螺旋結(jié)構(gòu)，是P蛋白與L和NP蛋白以及自身蛋白之間相互作用的主要區(qū)域[15]。

NDV P蛋白基因有1 451 bp和1 463 bp兩種核苷酸形式，分別編碼395、399個氨基酸，主要區(qū)別是Ⅰ類NDV的P基因在非編碼區(qū)插入了12 bp。SD18/13是2013年分離的基因10型Ⅰ類NDV ，P基因開放閱讀框全長1 200 bp，編碼399個氨基酸，與Ⅰ類NDV的氨基酸同源性為83.5%～98.5%，與Ⅱ類NDV的氨基酸同源性為67.2%～70.5%。SD18/13與法國分離株Teal/France/10010/2010聚于一簇，同屬于基因10型Ⅰ類NDV，兩者P基因的核苷酸同源性為98.2%，氨基酸同源性為98.5%。SD18/13雖然是Ⅰ類NDV，但與其他基因型Ⅰ類NDV毒株存在明顯的不同。通過P蛋白氨基酸序列比對也能發(fā)現(xiàn)這一差異，如P299L、V342I、G372S是分離株SD18/13所特有的氨基酸位點，這些位點位于P蛋白的C端部分（PCT），具體作用有待于進一步研究。整個P蛋白中絕大多數(shù)的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點都位于P蛋白的N端部分（PNT），通過序列比對發(fā)現(xiàn)這些位點的氨基酸殘基是比較保守的。

參 考 文 獻：

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