史志坤 朝陽市疾病預(yù)防控制中心 微生物檢測所 （遼寧 朝陽 122000）

內(nèi)容提要： 目的：探討實(shí)時熒光定量PCR儀用于流感病毒檢測的效果。方法：選擇2016年11月～2017年12月本實(shí)驗(yàn)室收治210例流感病樣病例的患者作為本次實(shí)驗(yàn)的研究對象，運(yùn)用實(shí)時熒光PCR法測定患者的咽拭子標(biāo)本的流感病毒核酸，檢測呈陽性標(biāo)本執(zhí)行MDCK培養(yǎng)并給予分離，分析兩種方法的檢測結(jié)果，對比特異性、靈敏度。結(jié)果：實(shí)時熒光定量PCR儀檢測出陽性標(biāo)本72例，陽性率34.3%；細(xì)胞培養(yǎng)法從72例陽性標(biāo)本中分離40例流感病毒，陽性率為19.0%。對比兩種方法檢測結(jié)果，實(shí)時熒光定量PCR儀檢測陽性率明顯比細(xì)胞培養(yǎng)法要高（P＜0.05）。結(jié)論：實(shí)時熒光定量PCR儀可以迅速且有效檢測出流感病毒核酸，成為高效診斷方式。

目前流感病毒呈現(xiàn)變異高度化，耐藥性日益增強(qiáng)，新亞型流感病毒不斷涌出等特點(diǎn)，防控流感病毒的形勢極為嚴(yán)峻[1]。本次實(shí)驗(yàn)選擇2016年11月～2017年12月本實(shí)驗(yàn)室收治的210例流感病樣病例的患者作為本次實(shí)驗(yàn)的研究對象，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如下。

1.資料與方法

1.1 標(biāo)本采集

選擇2016年11月～2017年12月本實(shí)驗(yàn)室收治的210例流感病樣病例的患者作為本次實(shí)驗(yàn)的研究對象，提取所有患者的咽拭子標(biāo)本，患者體溫都在38?C以上，并有咳嗽、咽痛等癥狀，標(biāo)本采集存放在3mL標(biāo)本管中，24h內(nèi)送去檢測。

1.2 實(shí)時熒光PCR檢測

所有標(biāo)本接受病毒核酸檢測，遵循試劑盒說明執(zhí)行RNA提取與反應(yīng)體系，運(yùn)用SDS軟件操作實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)，設(shè)立陽性與陰性對照，反應(yīng)程序分為以下：①5個循環(huán)：50?C定為30min、95?C定為3min、95?C定為15s、50?C定為30min、72?C定為1min；②40個循環(huán)：95?C定為10s、55?C定為40s。設(shè)定熒光素為FAM，當(dāng)55?C時，收集熒光信號。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)法檢測

經(jīng)實(shí)時熒光定量PCR儀檢測呈陽性標(biāo)本，運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)法對其加以分離、接種，再對其類型加以分類。以25mL/瓶的比例接種每份標(biāo)本，每份標(biāo)本2瓶，第2天觀察標(biāo)本有無細(xì)胞病變（CPE）。借助豚鼠血執(zhí)行血凝試驗(yàn)，對血凝素（HA）及其滴度進(jìn)行嚴(yán)密觀察，若HA滴度＜1:8或者陰性培養(yǎng)物盲傳第2代之后依舊呈陰性的，就拋棄這些標(biāo)本。根據(jù)國家流感中心提供的標(biāo)準(zhǔn)參照血清，對符合HA滴度試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)者試驗(yàn)HAI，并對病毒類型進(jìn)行分類。

1.4 檢測敏感性、特異性

經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)法檢測呈陽性菌株提取細(xì)胞培養(yǎng)液，依據(jù)實(shí)時熒光定量PCR儀檢測程序，再次開展檢驗(yàn)與病毒類型的分類。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

此次實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)全部由SPSS21.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料采用±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)對比；以%表示計數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)比較組間資料。以P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 對比兩種檢測方法的檢測結(jié)果

實(shí)時熒光PCR法檢測出72例陽性標(biāo)本，138例陰性，陽性率34.3%；病毒分離培養(yǎng)法檢測出40例陽性標(biāo)本，170例陰性，陽性率為19.0%。對比兩種方法檢測結(jié)果，實(shí)時熒光定量PCR儀檢測陽性率明顯比細(xì)胞培養(yǎng)法要高（P＜0.05）。

2.2 對比兩種方法檢測靈敏度、特異性

實(shí)時熒光PCR法檢測出72例陽性標(biāo)本，全部由病毒分離培養(yǎng)法檢測，其中45例呈陽性反應(yīng)，運(yùn)用MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)法測定的138例標(biāo)本呈陰性，而此138例標(biāo)本是經(jīng)實(shí)時熒光PCR法檢測呈陰性的標(biāo)本。MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)法與實(shí)時熒光PCR法檢測的一致率為87.1%，細(xì)胞分離培養(yǎng)法靈敏度是實(shí)時熒光PCR法的62.5%，特異性則為100%，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1.對比兩種方法檢測靈敏度、特異性(n)

3.討論

流感病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷流感病毒最常用的方法就是分離病毒、鑒定病毒，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行分離的流感病毒可以確保流感病毒的抗原性與原始標(biāo)本保持一致性，以利長時間儲存，可以較好分析病毒抗原性和基因[2]。但是MDCK細(xì)胞所分離的病毒不可以用來生產(chǎn)疫苗，根據(jù)現(xiàn)行實(shí)踐研究結(jié)果判斷，細(xì)胞培養(yǎng)法的檢出率會受到病毒載量、被檢樣品質(zhì)量的一定影響，如果被檢樣品質(zhì)量較低或病毒載量不夠時，就易產(chǎn)生假陰性[3]。此外，細(xì)胞培養(yǎng)法僅適用于活體病毒，因此收集標(biāo)本、保存標(biāo)本時，需要保證病毒活性。

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）可以擴(kuò)增特定核苷酸片的指數(shù)級，結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)后，運(yùn)用凝膠電泳方式定性分析擴(kuò)增物，借助放射核素進(jìn)行標(biāo)記后的光密度掃描方式，開展定量分析[4]。實(shí)時定量PCR指實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號，從而定量與定性分析起始模板，隨著實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物的增多，熒光信號強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，當(dāng)歷經(jīng)一個循環(huán)，就有一個熒光強(qiáng)度信號被收集到，如此以來，就可憑借熒光強(qiáng)度的變化，觀測產(chǎn)物量變化情況，最終構(gòu)成熒光擴(kuò)增曲線圖[5]。

實(shí)時定量PCR檢測法提取病毒RNA時間在2.5～4h左右，針對甲型流感病毒此法有較高特異性，可以識別多株多亞型甲型流感病毒，對比血清學(xué)診斷法、特異性抗體檢測法，此法有較高靈敏性，但是實(shí)時定量PCR檢測法需要在條件較高的實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施，實(shí)驗(yàn)室要求配備特殊儀器，需要專業(yè)操作人員操作，難以全面普及。

實(shí)時熒光PCR檢測法可以準(zhǔn)確、迅速、靈敏檢測流感病毒，被國內(nèi)廣泛應(yīng)用于臨床診斷。

本次試驗(yàn)研究結(jié)果表明，實(shí)時熒光PCR法檢測出72例陽性標(biāo)本，138例陰性，陽性率34.3%；病毒分離培養(yǎng)法檢測出40例陽性標(biāo)本，170例陰性，陽性率為19.0%；對比兩種方法檢測結(jié)果，實(shí)時熒光定量PCR儀檢測陽性率明顯比細(xì)胞培養(yǎng)法要高。實(shí)時熒光PCR法檢測出72例陽性標(biāo)本，全部由病毒分離培養(yǎng)法檢測，其中45例呈陽性反應(yīng)，運(yùn)用MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)法測定的138例標(biāo)本呈陰性，而此138例標(biāo)本是經(jīng)實(shí)時熒光PCR法檢測呈陰性的標(biāo)本。MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)法與實(shí)時熒光PCR法檢測的一致率為87.1%，細(xì)胞分離培養(yǎng)法靈敏度是實(shí)時熒光PCR法的62.5%，特異性則為100%。

綜上所述，實(shí)時熒光PCR法可以準(zhǔn)確、迅速檢測流感病毒核酸，有著高特異性、高靈敏性、便捷的優(yōu)勢，可以成為實(shí)驗(yàn)室快速診斷流感病毒的高效方式。