朱靜，張志東，劉曉靜，唐琦勇，王博，顧美英，宋素琴，王瑋，張麗娟

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】在生物農(nóng)藥推廣應(yīng)用中，光線特別是紫外光對(duì)農(nóng)藥的影響最為突出。光線易促使農(nóng)藥加速降解，減慢藥效發(fā)揮，降低藥效或造成防治效果不穩(wěn)定。新疆作為強(qiáng)太陽光輻射地區(qū)，生物農(nóng)藥失效速度更快，往往需夜間施藥，或需多次施藥，增加了使用成本[1]。自20世紀(jì)80年代以來，越來越多來源于植物和微生物的農(nóng)藥光保護(hù)劑被研究發(fā)現(xiàn)[2,3]，這些光保護(hù)劑能有效的保護(hù)生物農(nóng)藥的光破壞特別是紫外光的破壞，且多數(shù)為生物安全和環(huán)境友好性助劑，但其高昂的提取和合成成本，往往優(yōu)先用于化妝品中[4]，且在使用農(nóng)藥時(shí)，一般需添加農(nóng)藥的1%以上才會(huì)起到較好的效果[5]，提高生物農(nóng)藥的銷售價(jià)格及防治成本，還需要探索更適于生產(chǎn)和推廣的光保護(hù)劑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】天然黑色素(melanin)是一種廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中的非均質(zhì)類多酚聚合體，是一類高分子量褐色-黑色素的總稱[6]。黑色素在紫外線和可見光波長(zhǎng)(150～800 nm)均具有良好的光吸收作用，其清除自由基、抗氧化功能均優(yōu)于SOD、VE等常規(guī)抗氧化產(chǎn)品，是理想的生物農(nóng)藥光保護(hù)劑[7,8]。出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)是工業(yè)生產(chǎn)重要生物材料短梗霉多糖(英文名Pullulan)的生產(chǎn)菌株，此前的研究和生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)該菌在發(fā)酵后期易代謝出黑色素，其與多糖牢固結(jié)合，具有良好的水溶性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期從新疆輻射污染土樣中分離篩選出一株出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)菌株MF1[9]，可產(chǎn)生水溶性黑色素，具有較好的熱、酸堿穩(wěn)定性，并且對(duì)H2O2、NaClO和金屬離子有較好的耐受性。其發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)，極具開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。研究天然黑色素對(duì)生物農(nóng)藥的光保護(hù)作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】將短梗霉發(fā)酵的黑色素溶液與生物農(nóng)藥配伍，用于棉田噴灑。通過裂區(qū)試驗(yàn)研究生物農(nóng)藥與黑色素對(duì)蚜蟲殺蟲率及棉田產(chǎn)量的影響，分析生物農(nóng)藥與黑色素的最佳濃度配比，為天然黑色素在生物農(nóng)藥中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地點(diǎn)為新疆石河子市148團(tuán)(E 86°16' 24.870"，N 44°46' 05.882")，該區(qū)域地處古爾班通古特大沙漠南緣，平均海拔高度450.8 m，屬典型的溫帶大陸性氣候，冬季長(zhǎng)而嚴(yán)寒，夏季短而炎熱，平均氣溫25.1～26.1℃，無霜期為168～171 d，年降水量為125.0～207.7 mm。試驗(yàn)小區(qū)所在棉田常年種植棉花，連作年限10 a以上。棉田種植采用膜下滴灌，機(jī)械化耕作。

1.1.2 菌種及試劑

試驗(yàn)菌株出芽短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)MF1分離自新疆輻射污染環(huán)境土壤，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所提供。

棉花品種為新陸早30號(hào)(新疆石河子下野地試驗(yàn)站繁育)；蘇云金桿菌Bt(廣州多宇多生物科技有限公司)、阿維菌素(河北省農(nóng)藥化工有限公司)和甲維丙溴磷(山東新勢(shì)立生物科技有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(MEA 培養(yǎng)基)：麥芽浸粉30 g，大豆蛋白胨3 g，純凈水1 000 mL，pH 自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，酵母浸膏2.02 g，磷酸氫二鉀3.0 g，硫酸銨2.0 g，NaCl 0.5 g，CuSO40.16 mg，純凈水1 000 mL，pH自然。

1.1.4 儀器與設(shè)備

PL203 電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SPX-150B 生化培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；Eppendorf 5424 離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf 股份公司；UV-2550 紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

黑色素對(duì)生物農(nóng)藥的保護(hù)作用及對(duì)棉花產(chǎn)量的影響試驗(yàn)采用裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11]，農(nóng)藥使用與農(nóng)田生產(chǎn)所用一致，即每667 m2Bt 50 g、阿維菌素10 mL、甲維丙溴磷 25 g，溶于50 kg水中，噴灑。裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì)以農(nóng)藥用量為主處理，黑色素使用量為副處理。農(nóng)藥用量以農(nóng)田使用量為100%，設(shè)A1～A3分別為100%、75%、50%三個(gè)梯度；黑色素使用量以每667 m2使用黑色素2.5 g為100%，設(shè)B1～B7的0、10%、20%、40%、60%、80%、100%七個(gè)濃度梯度。試驗(yàn)共有21個(gè)處理，3個(gè)重復(fù)，共設(shè)63個(gè)小區(qū)。小區(qū)面積5 m×4.6 m，采用隨機(jī)設(shè)計(jì)分布，試驗(yàn)過程采用人工背負(fù)式噴霧器打藥，噴水量為50 kg/667 m2，均勻噴霧，其他管理措施與非試驗(yàn)棉田基本相同。

1.2.2 黑色素發(fā)酵

從新鮮斜面挑取一環(huán)菌苔，接種于液體種子培養(yǎng)基試管中，30℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)36 h，取2 mL 接種于搖瓶中(500 mL三角瓶裝200 mL種子培養(yǎng)基)，30℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)2 d，按5%接種量接種于10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵條件：發(fā)酵培養(yǎng)基裝填量7 L，起始pH 6.2，消泡劑10 mL，通氣量3.5 L/min，30℃，100 r/min，發(fā)酵5～7 d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液高溫滅菌，離心去除發(fā)酵雜質(zhì)及菌體，上清液放置在4℃冰箱備用[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

蚜蟲數(shù)量測(cè)定：于施藥前1 d和施藥后1、3、5 d，采用對(duì)角線5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)隨機(jī)調(diào)查10株棉花，每株調(diào)查5片葉的蚜蟲數(shù)[12]，分別統(tǒng)計(jì)蚜蟲數(shù)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Duncan’s分析[13]。

棉花產(chǎn)量測(cè)定：待棉花收獲時(shí)，每個(gè)處理小區(qū)采用人工采摘，并進(jìn)行單收單曬以計(jì)算籽棉產(chǎn)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Duncan’s分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂區(qū)試驗(yàn)對(duì)蚜蟲數(shù)量的影響

將試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)整理成主區(qū)A因素(生物農(nóng)藥濃度)與裂區(qū)B因素(黑色素濃度)施藥前蚜蟲基數(shù)和施藥1、3和5 d后蚜蟲數(shù)量?jī)上虮?，?jì)算生物農(nóng)藥與黑色素配伍施用后殺蟲百分率。對(duì)殺蟲率兩因素裂區(qū)試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。F測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明：施藥天數(shù)間，天數(shù)×A的P值都大于0.05，說明三次重復(fù)之間以及因素A與三次重復(fù)之間的交互作用差異不顯著。A因素、B因素、A×B互作均達(dá)到極顯著差異，不同的農(nóng)藥濃度、黑色素濃度殺蟲效率不同，兩個(gè)因素需要合理組合才能獲得最好的殺蟲效果。分別對(duì)因素A、因素B進(jìn)行多重比較并對(duì)A×B交互作用進(jìn)行分析。表1～4，圖1

表1 各小區(qū)蚜蟲防治效果
Table 1 Control effect of aphid in each plot

注：表中活蟲頭數(shù)為3次重復(fù)的平均值，下同

Note： The number of live insects in the table is the average of 3 replicates, the same as the table below.

表2 裂區(qū)試驗(yàn)對(duì)蚜蟲數(shù)量影響方差
Table 2 Variance analysis of split-plot tests on aphid populations

變異來源Sources of variation自由度dfDegree of freedom平方和SSSquare sum均方S2Mean SquareF值F valuePP value施藥天數(shù) Application days22.7331.3661.5460.260因素A Factor A218.5919.29539.7580.002誤差 Error40.9350.234因素B Factor A6177.62629.60434.3800.000誤差 Error1210.3330.861A×B1240.1033.34215.8300.000誤差 Error245.0670.211

圖1 因素A與因素B對(duì)殺蟲率交互作用
Fig.1 The interaction of factor A and factor B on pesticidal rate

研究表明，因素A的三個(gè)水平分屬不同子集，其中A2的殺蟲效率最高，均值為95.47%。七個(gè)水平分屬5個(gè)不同的子集，其中B7的殺蟲率最高，均值97.42%。A3B7組合時(shí)達(dá)到最高值，即農(nóng)藥濃度選擇原液濃度的50%，黑色素使用量為100%時(shí)，即每667 m2使用Bt 25 g、阿維菌素5 mL、甲維丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g，可實(shí)現(xiàn)最大的殺蟲率，均值是97.7%。表3，表4，圖1

表3 主區(qū)因素A主效應(yīng)多重比較
Table 3 Multiple comparison analysis table

of main factor A main effect Duncana,b

注：誤差項(xiàng)為均值方(錯(cuò)誤)=0.38；a.使用調(diào)和均值樣本大小=3.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 0.38； a.Use the harmonic mean sample size = 3.000

表4 裂區(qū)因素B主效應(yīng)多重比較

Table 4 Multiple comparison analysis table of secondary factor B main effect Duncana,b

注：誤差項(xiàng)為均值方(錯(cuò)誤)=0.428；a.使用調(diào)和均值樣本大小=9.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 0.428； a.Use the harmonic mean sample size = 9.000

2.2 裂區(qū)試驗(yàn)對(duì)棉花產(chǎn)量的影響

從方差分析中看出主區(qū)因素A、A×B的交互作用引起的產(chǎn)量沒有差異性，但裂區(qū)因素B之間存在一定的差異性。主區(qū)三個(gè)處理之間沒有顯著性差異，三個(gè)處理下棉花產(chǎn)量由大到小的順序是A3>A2>A1。裂區(qū)7個(gè)處理之間存在一定的差異性，產(chǎn)量隨著黑色素的使用量增加而提高。A3B7處理的產(chǎn)量最高，即生物農(nóng)藥濃度選擇原液濃度的50%，黑色素使用量為100%時(shí)，即每667 m2使用Bt 25 g、阿維菌素5 mL、甲維丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g棉花產(chǎn)量最高，其結(jié)果與蚜蟲最佳防治組合一致，小區(qū)平均單產(chǎn)可以達(dá)到14.3 kg。表5～8，圖2

表5 各小區(qū)棉花產(chǎn)量
Table 5 Cotton production in each plot(kg)

主區(qū)Main treatment裂區(qū)Secondary treatment重復(fù)ⅠRepeatⅠ重復(fù)ⅡRepeatⅡ重復(fù)ⅢRepeatⅢ平均值MeanA1B18.251111.510.3B210111110.7B310.59.513.511.2B412.21112.511.9B510.5131211.8B613.51412.513.3B7141513.514.2A2B1910.59.79.7B210.511.512.511.5B31012.51311.8B411.512.513.512.5B5151311.2513.1B613.513.51514B715.25141314.1A3B198.759.259B210.5149.511.3B3141210.512.2B412.2513.513.513.1B51412.51413.5B6141412.513.5B715131514.3

表6 裂區(qū)試驗(yàn)對(duì)棉花產(chǎn)量影響方差
Table 6 Variance analysis of split-plot tests on cotton production

變異來源Sources of variation自由度dfDegree of freedom平方和SSSquare sum均方S2Mean SquareF值F valueP值P value區(qū)組 Plot21.4830.7421.3480.656誤差 Error0.4210.2320.550因素A Factor A23.5241.7621.3200.363誤差 Error45.3411.335因素B Factor B6127.39621.23318.1580.000誤差 Error1214.0321.169A×B128.9990.7500.3840.957誤差 Error2446.9061.954

表7 主區(qū)因素A主效應(yīng)多重比較

Table 7 Multiple comparison analysis table of

注：誤差項(xiàng)為均值方(錯(cuò)誤)=0.19；a.使用調(diào)和均值樣本大小=3.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 0.19； a.Use the harmonic mean sample size = 3.000

表8 裂區(qū)因素B主效應(yīng)多重比較
Table 8 Multiple comparison analysis table of

secondary factor B main effect Duncana,b

注：誤差項(xiàng)為均值方(錯(cuò)誤)=1.693；a.使用調(diào)和均值樣本大小=9.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 1.693； a.Use the harmonic mean sample size = 9.000

圖2 因素A與因素B對(duì)產(chǎn)量交互作用
Fig.2 The interaction of factor A and factor B on production

3 討 論

新疆作為我國(guó)棉花集中生產(chǎn)區(qū)，2016年棉花產(chǎn)量占到全國(guó)棉花產(chǎn)量的80%。新疆棉區(qū)氣候干燥，降水稀少，日照時(shí)間長(zhǎng)且強(qiáng)度大，全年日照時(shí)數(shù)為2 550～3 500 h，日照百分率60%～80%[14]，為新疆棉花優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)創(chuàng)造了優(yōu)良的自然條件。但在蟲害發(fā)生時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度的日照也嚴(yán)重破壞了生物農(nóng)藥的作用。相關(guān)研究表明，我區(qū)生物農(nóng)藥蘇云金芽孢桿菌(Bt) 在使用過程中，陽光直射30 min，芽孢死亡率即達(dá)50%左右，照射1 h死亡率達(dá)80%，其伴胞晶體也隨之變形降效，甚至無效；阿維菌素及棉鈴蟲多角體病毒在陽光照射下也會(huì)迅速失效[15,16]。因此，自20世紀(jì)80年代以來，光保護(hù)劑作為生物農(nóng)藥的重要助劑之一，尋找高效、安全、經(jīng)濟(jì)的農(nóng)藥光保護(hù)劑一直是生物農(nóng)藥研究的主要領(lǐng)域之一。

研究中采用的天然黑色素具有極強(qiáng)的抗日光及紫外線照射作用，且具有較強(qiáng)的酸堿、熱穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)氧化還原反應(yīng)不敏感，具有螯合部分重金屬的作用[17]。使用之前只需將發(fā)酵液高壓滅菌后，簡(jiǎn)單過濾即可與生物農(nóng)藥直接混合噴灑。與其他光保護(hù)劑或黑色素制品相比，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)易，環(huán)保安全。在大田條件下，研究以生物農(nóng)藥用量為主處理，黑色素用量為副處理進(jìn)行裂區(qū)試驗(yàn)。通過試驗(yàn)優(yōu)化，當(dāng)農(nóng)藥濃度為原液濃度的50%，黑色素濃度為100%時(shí)，即每667 m2使用Bt 25 g、阿維菌素5 mL、甲維丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g時(shí)，試驗(yàn)小區(qū)平均蚜蟲殺蟲率最佳，可達(dá)到97.7%，平均棉花產(chǎn)量達(dá)14.3 kg。而相同條件下未使用黑色素的對(duì)照試驗(yàn)小區(qū)中，蚜蟲平均殺蟲率僅為92.3%，棉花平均產(chǎn)量10.3 kg。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分小區(qū)的殺蟲效率和棉花產(chǎn)量隨著黑色素使用的濃度升高而提高。在研究中生物農(nóng)藥的使用量卻并非越高越好。無論殺蟲率或棉花產(chǎn)量，均在農(nóng)藥使用量為常規(guī)用量濃度的一半時(shí)(50%)效果最佳，這一結(jié)果可能是由于單位黑色素對(duì)生物農(nóng)藥的保護(hù)作用有限，當(dāng)農(nóng)藥濃度過大時(shí)，現(xiàn)有濃度的黑色素難以進(jìn)行保護(hù)從而導(dǎo)致農(nóng)藥效果下降。因此，75%和100%濃度的農(nóng)藥使用效果反而不佳。

通過對(duì)未加黑色素的生物農(nóng)藥防效的分析發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)中生物農(nóng)藥的推薦使用量與使用其一半時(shí)的防效幾乎無差別。過量施用、盲目施用農(nóng)藥和化學(xué)肥料，會(huì)導(dǎo)致農(nóng)田土壤健康情況下降，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)情況變差和病蟲害的多發(fā)。研究利用天然黑色素與生物農(nóng)藥的配伍，不僅可以提高生物農(nóng)藥的使用效率，減少農(nóng)藥的施用量，降低生物農(nóng)藥的使用成本，對(duì)維護(hù)良好的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境具有積極的作用。

4 結(jié) 論

通過農(nóng)藥濃度與黑色素濃度裂區(qū)試驗(yàn)對(duì)蚜蟲殺蟲率及棉田產(chǎn)量進(jìn)行研究，當(dāng)農(nóng)藥濃度為原液濃度的50%，黑色素濃度為100%時(shí)，即每667 m2使用Bt 25 g、阿維菌素5 mL、甲維丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g時(shí)，可達(dá)到97.7%的最大蚜蟲殺死率，以及均值14.3 kg/小區(qū)的最大棉花產(chǎn)量，顯著高于對(duì)照小區(qū)的試驗(yàn)結(jié)果。研究生物農(nóng)藥與黑色素的最佳濃度配比，為天然黑色素在生物農(nóng)藥中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。