鄭學(xué)斌， 張清科， 朱詠梅， 竺俊全

(1. 寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211； 2. 浙江省新昌縣水產(chǎn)技術(shù)推廣中心, 新昌 311300)

精子活力是精子生理特性的主要研究內(nèi)容，也是精子質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)；精子活力與受精能力密切相關(guān)[1]。魚類精子的活力可通過測(cè)定精子的激活率、運(yùn)動(dòng)程度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命等來確定。探明環(huán)境因子對(duì)魚類精子活力的影響不僅有利于闡明精子的生理特性，而且也有助于人工授精中精子激活液的配制及精子低溫保存用稀釋液成分的確定[2]，對(duì)其人工繁殖及精子冷凍均有重要的參考價(jià)值[3-4]。目前，經(jīng)濟(jì)魚類精子活力或精子生理特性的研究已見較多報(bào)道，如在淡水魚類中已見對(duì)中華鱘(Acipensersinensis)[5]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[6]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[7]、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)[8]、細(xì)鱗斜頜鲴(Plagionathopsmicrolepis)[9]、光唇魚(Acrossocheilusfasciatus)[10]等種類精子活力或生理特性的研究報(bào)道。

馬口魚(Opsariicjthysbidens)屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、魚丹亞科(Danioninae)、馬口魚屬(Opsariichthys)，俗稱山鱤、桃花魚、大口扒等，是一種廣泛分布于東亞江河、湖泊及山澗溪流等清澈水體中的小型經(jīng)濟(jì)魚類，喜集群生活，以小魚、小蝦、水生昆蟲等為食。馬口魚肉質(zhì)肥嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，頗受消費(fèi)者喜愛。近年來，由于水環(huán)境的污染、捕撈過度等原因，導(dǎo)致馬口魚自然資源的衰退。因此，馬口魚的資源保護(hù)及增養(yǎng)殖技術(shù)開發(fā)受到重視。目前，對(duì)馬口魚的研究已見系統(tǒng)分類[11]、遺傳[12-13]、胚胎發(fā)育[14]、消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)[15]、營養(yǎng)成分分析[16]、人工繁殖及養(yǎng)殖技術(shù)[17]等方面，但馬口魚精子活力或生理特性的研究未見報(bào)道。本文通過顯微觀察法，研究了pH值、葡萄糖及離子等環(huán)境因子對(duì)馬口魚精子活力的影響，旨在積累馬口魚精子生理特性資料，為其人工繁殖及精子冷凍保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用馬口魚雄魚于2017年7月取自浙江新昌縣榮欣水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，挑選成熟度良好的雄魚20尾，體長12.3～14.6 cm，體重22.9～32.1 g，暫養(yǎng)于水泥池內(nèi)，供采精用。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)溶液的配制

1)不同pH值溶液的配制。pH值梯度分13組，每組取500 mL去離子水，滴加1 mol/L的HCl或NaOH，配制pH值梯度為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10的實(shí)驗(yàn)溶液。

2)不同濃度葡萄糖、KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液的配制。往去離子水中分別添加0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5 g的葡萄糖、KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2，定溶至500 mL，配制成濃度梯度為1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 g/L的葡萄糖、KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液。

3)不同濃度Cd2+溶液的配制。往去離子水中添加0.407 7 g CdCl2，定溶至500 mL，配制成Cd2+濃度為500 mg/L的母液，依次取100 mL母液逐級(jí)稀釋，配制成Cd2+濃度梯度為0.000 5、0.005、0.05、0.5、5、50和500 mg/L的實(shí)驗(yàn)溶液。

1.2.2 精液的采集

用潔凈的干毛巾擦干馬口魚雄魚生殖孔周圍體表，輕壓魚腹使精液自然流出，用移液槍吸取無尿污精液于離心管中，冰浴保存，實(shí)驗(yàn)盡快進(jìn)行。

1.2.3 精子活力觀察

用移液槍吸取微量精液于載玻片上，滴加事先配制好的實(shí)驗(yàn)溶液并迅速用槍頭將其攪勻，然后在光鏡下觀察精子的激活率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命。精子的激活率以激活起始時(shí)給定視野內(nèi)被激活精子數(shù)量占全部精子數(shù)量的百分?jǐn)?shù)計(jì)算。精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間以精子激活開始至90%的精子原地顫動(dòng)為止的時(shí)間計(jì)算。精子的壽命以精子自然激活開始至90%的精子停止運(yùn)動(dòng)為止的時(shí)間計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及單因素方差分析采用SPSS 19.0完成，以P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 精液中精子濃度

用血球計(jì)數(shù)板-顯微觀察法測(cè)出馬口魚精液中精子的平均濃度為(1.227±0.13)×1010/mL。

2.2 pH值對(duì)馬口魚精子活力的影響

溫度27℃～28℃，pH值對(duì)馬口魚精子活力的影響見表1。pH值在4.0～10.0范圍內(nèi)均有一定比例的精子被激活；pH值在5.5～8.5范圍內(nèi)，激活率大于50%；pH值在6.0～7.5范圍內(nèi)，激活率大于60%，無顯著差異；pH值為6.0時(shí)，精子激活率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別達(dá)(77.67±3.51)%、(43.00±2.08)s和(47.67±1.00)s。

表1 pH值對(duì)馬口魚精子活力的影響

注：*差異顯著,P<0.05；**差異極顯著,P<0.01；pH=6.0激活液為對(duì)照組；下同

2.3 葡萄糖溶液對(duì)馬口魚精子活力的影響

溫度27℃～28℃，不同濃度葡萄糖溶液對(duì)馬口魚精子活力的影響見表2。葡萄糖濃度在1～5 g/L范圍內(nèi)，精子未能激活。葡萄糖濃度在6～10 g/L范圍內(nèi)，雖有一定比例的精子被激活，但激活率總體較低，與對(duì)照組差異顯著；葡萄糖濃度在9 g/L時(shí)，精子激活率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別為(41.66±7.02)%、(9.33±8.62)s和(51.00±19.70)s，而且僅此組觀察到精子激活后的正常運(yùn)動(dòng)，其他組精子激活后只原地顫動(dòng)。

表2 不同濃度的葡萄糖溶液對(duì)馬口魚精子活力的影響

2.4 KCl、NaCl、MgCl2和CaCl2溶液對(duì)馬口魚精子活力的影響

溫度27℃～28℃，不同濃度的KCl、NaCl、MgCl2和CaCl2溶液對(duì)馬口魚精子活力的影響見表3～5。KCl溶液濃度在2～8 g/L范圍內(nèi)均有精子被激活，其中在5 g/L時(shí)精子激活率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別達(dá)(80.00±5.29)%、(108.67±18.04)s和(697.00±47.03)s，與對(duì)照組差異顯著；在1、9和10 g/L KCl溶液中精子未被激活。NaCl溶液濃度在2～7 g/L范圍內(nèi)均有一定比例精子被激活，其中在4～5 g/L時(shí)精子激活率相對(duì)較高，運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命較長；NaCl 4 g/L時(shí)，精子激活率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別為(60.33±7.77)%、(33.00±13.11)s和(208.00±54.84)s；在1 g/L及8～10 g/L NaCl溶液中精子未被激活。MgCl2溶液濃度在1～5 g/L范圍內(nèi)時(shí)，有一定比例精子被激活，但僅在原地顫動(dòng)。CaCl21～5 g/L范圍內(nèi)，精子有一定比例被激活，CaCl21g/L時(shí)，精子的激活率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命分別達(dá)(50.33±1.53)%、(31.00±1.00)s及(34.67±2.52)s。MgCl2和CaCl2溶液濃度≥6 g/L時(shí)，精子未被激活。

表3 不同濃度KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2溶液對(duì)馬口魚精子激活率的影響

表4 不同濃度KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2溶液對(duì)馬口魚精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

2.5 重金屬Cd2+對(duì)馬口魚精子活力的影響

溫度27℃～28℃，不同濃度的Cd2+溶液對(duì)馬口魚精子活力的影響見表6。在0.000 5～5 mg/LCd2+濃度范圍內(nèi)均有較高比例的精子被激活，被激活后，精子運(yùn)動(dòng)劇烈，對(duì)Cd2+非常敏感，快速運(yùn)動(dòng)過后立即死亡。隨著Cd2+濃度的上升，精子的激活率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命呈下降趨勢(shì)，在50 mg/L及500 mg/L Cd2+濃度下，精子立即出現(xiàn)凝集致死現(xiàn)象。

表5 不同濃度KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2溶液對(duì)馬口魚精子壽命的影響

表6 鎘離子對(duì)馬口魚精子活力的影響

3 討論

3.1 pH值對(duì)精子活力的影響

研究表明，大多數(shù)魚類精漿pH值偏堿性，介于7.3～8.5之間[19]，酸性環(huán)境會(huì)減弱或抑制精子的活力，多數(shù)魚類在偏堿性水體中精子活力較高。據(jù)研究，pH值低于5.5時(shí)草魚精子不能激活[6]，pH值分別為8.64和8.5時(shí)，草魚[6]和江鱈(Lotalota)[20]精子的活力最高；同樣，pH值8.0時(shí)，黃顙魚[7]、胭脂魚[8]等魚類精子的活力最高。本研究，馬口魚精子在pH值4.0～10.0內(nèi)均有一定比例精子被激活，精子能夠被激活的pH范圍較廣，對(duì)酸性環(huán)境具有一定的耐受性，并且，差異顯著分析顯示馬口魚精子激活與運(yùn)動(dòng)的適宜pH值為6.0～7.5，在pH值6.0時(shí)活力最好。從表7可見，馬口魚精子適宜的pH值與其他淡水魚類有一定的差異，適宜的pH值范圍相對(duì)較低。

3.2 葡萄糖對(duì)精子活力的影響

表7中，各種魚類適宜的葡萄糖濃度差異較大，高體雅羅魚[19]、江鱈[20]、烏原鯉[21]等魚類在較高濃度的葡萄糖溶液中能被激活。研究表明，體外受精魚類的精子能夠利用外源性小分子單糖來補(bǔ)充自身能量的消耗[22]，這在葡萄糖對(duì)中華鱘[5]、高體雅羅魚[19]、江鱈[20]、烏原鯉[21]等魚類精子活力影響的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。然而，在胭脂魚[8]、細(xì)鱗斜頜鲴[9]、光唇魚[10]等魚類精子生理特性的研究中并未得到類似結(jié)果，葡萄糖對(duì)其精子的活力無促進(jìn)作用。本研究中，馬口魚精子在葡萄糖溶液的激活率不高、壽命也沒有明顯延長，可見，不同種魚類對(duì)葡萄糖的吸收、利用是有差別的。

表7 部分淡水魚類精子適宜的環(huán)境因子數(shù)值

3.3 離子對(duì)精子活力的影響

水體中的K+、Na+、Ca2+及Mg2+是激活魚類精子的重要因子[23]，離子濃度的變化對(duì)魚類精子活力的影響頗大[4]，并且，不同魚類精子對(duì)相同離子的適應(yīng)范圍往往不同。

K+和Na+是鯉(Crprinuscarpio)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)等主要淡水魚類精漿的主要組成部分，占元素組成的90%以上，在調(diào)節(jié)精漿滲透壓和精子運(yùn)動(dòng)能力中起著重要的作用[24]。據(jù)研究，K+對(duì)鮭科魚類精子活力具有明顯的抑制作用[25-26]，相反，它對(duì)鯉科魚類精子的活力具有一定的促進(jìn)作用[27]。實(shí)驗(yàn)證明，適宜濃度的K+能延長細(xì)鱗斜頜鲴[9]、光唇魚[10]、鯉魚[27]、金魚(Carassiusauratus)[27]等精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命。由表7可見，不同種魚類精子適宜的KCl、NaCl溶液濃度不同。本研究中，馬口魚精子在5 g/L的KCl溶液中運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命得到顯著延長，其運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別是pH值為6.0組的2.5倍和14.8倍，差異極顯著，這說明適宜濃度的K+溶液對(duì)馬口魚精子的活力具有明顯的提升作用。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，可用5 g/L的KCl溶液作為馬口魚人工授精的激活液，延長精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間，提高受精率。除K+以外，Na+對(duì)馬口魚精子活力也有一定的促進(jìn)作用，但其促進(jìn)程度不及K+。類似的研究表明，適宜濃度的Na+溶液也能在一定程度上提高中華鱘[5]、黃顙魚[7]、光唇魚[10]、高體雅羅魚[19]等精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命。

Ca2+和Mg2+對(duì)中華鱘[5]、細(xì)鱗斜頜鲴[9]精子活力有一定的抑制作用，而光唇魚[10]精子在1～10 g/L的CaCl2及MgCl2溶液中均未能激活，但它們對(duì)胭脂魚[8]、江鱈[20]、烏原鯉[21]精子沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用。可見，不同魚類精子對(duì)Ca2+和Mg2+適應(yīng)能力不同。據(jù)報(bào)道，Ca2+和Mg2+對(duì)鯉、團(tuán)頭魴精子的活力均有抑制作用，且該抑制作用不是滲透壓所引起，而是離子本身的作用[28]。在研究Ca2+對(duì)白斑狗魚(Esoxlucius)精子活力影響的實(shí)驗(yàn)中也得出，Ca2+對(duì)其精子活力的影響與滲透壓無關(guān)[29]。本研究也觀察到類似現(xiàn)象，用MgCl2溶液激活馬口魚精子后，能被激活的精子只做原地顫動(dòng)，而用CaCl2溶液激活馬口魚精子后，雖有一定的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，但其激活率和運(yùn)動(dòng)時(shí)間均較低，精子活力受到抑制。Ca2+和Mg2+也是淡水魚類精漿組成成分，但其含量極低(不到1%)[24]，其作用效果與K+和Na+不同，具體原因有待進(jìn)一步研究。

在研究Cd2+對(duì)馬口魚精子活力影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，馬口魚精子的運(yùn)動(dòng)非常劇烈，快速運(yùn)動(dòng)過后立即死亡，其激活率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及壽命都隨Cd2+濃度的升高呈逐漸下降趨勢(shì)，在Cd2+濃度為50 mg/L及500 mg/L時(shí)，精子立即出現(xiàn)凝集致死，這說明Cd2+對(duì)馬口魚精子存在一定的毒害作用，高濃度的Cd2+可使其直接致死。類似的結(jié)果在中華鱘[5]及泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[30]精子生理特性的研究中也有報(bào)道，重金屬Cu2+對(duì)中華鱘精子有很強(qiáng)的抑制作用，較低濃度的CuCl2溶液即可使精子很快死亡，而Cd2+對(duì)泥鰍精子活力的影響存在明顯的濃度依賴性，即激活液中Cd2+濃度越高，精子的激活率就越低。