劉勇勁 李冬梅 劉小飛 朱根發(fā)

摘要 以小花山柰無(wú)菌苗的芽基部為外植體，對(duì)芽基部進(jìn)行繼代增殖、叢生芽誘導(dǎo)以及生根培養(yǎng)基的篩選，建立了小花山柰無(wú)菌苗芽基部的組培快繁體系。結(jié)果表明：小花山奈無(wú)菌苗芽基部繼代增殖比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA8.0～10.0mg/L+NAA0～0.10mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉膠粉10g/L，最佳的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA8.0mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉膠粉10g/L;叢生芽誘導(dǎo)比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.10mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉膠粉10g/L，最佳的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.05mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉膠粉10g/L;生根最佳的培養(yǎng)基為MS+NAA0.10mg/L+香蕉泥15%+活性炭1g/L+白沙糖30g/L+卡拉膠粉9.5g/L。

關(guān)鍵詞 小花山奈;芽基部;增殖;芽誘導(dǎo);生根

中圖分類號(hào) S682.36 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

小花山奈（Kaempferia parviflora）屬于姜科（Zingiberaceae）山奈屬（Kaempferia）植物，株高約30cm，葉叢生，葉片橢圓形，葉面綠色，葉緣紅色，葉背具暗紅色斑紋;花序包藏于一鐘狀總苞內(nèi)，花多數(shù)較小，依次開(kāi)放，花白色，唇瓣具紫紅色斑紋;花期5～10月;根莖塊狀，藥用;觀葉類，株形好，葉漂亮可賞，可作為室內(nèi)觀葉和林下地被植物[1-2]。小花山奈不結(jié)果，故不能進(jìn)行播種繁殖;其也沒(méi)有莖桿，也不能用莖桿扦插繁殖;其根莖塊狀，也不能用帶葉根莖扦插[1-4]。因此，只能采用切分根莖和組織培養(yǎng)的方法繁殖。由于母本量不足，切分根莖分株繁殖速度慢，而且對(duì)母株損傷大，短期內(nèi)得不到大量種苗。

選用姜科山奈（Kaempferia galanga）塊莖上剛萌發(fā)的芽為外植體時(shí)，用75%酒精消毒1min，無(wú)菌水漂洗1次，0.1%升汞消毒10min，無(wú)菌水漂洗2次，0.1%升汞消毒6min的消毒效果最好，存活率56.66%，污染率6.67%，但外植體存活數(shù)天后，有細(xì)菌污染現(xiàn)象，這可能是山奈自身帶有內(nèi)生菌所致，導(dǎo)致外植體滅菌困難[5]。由于山奈屬植物的多樣性和塊莖自身帶有內(nèi)生菌，故采用常規(guī)組織培養(yǎng)的消毒程序滅菌困難。山奈塊莖剛萌發(fā)的芽為外植體時(shí)，適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L，芽的萌發(fā)率100%，分化率146.67%[5].筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，取小花山奈塊莖上萌發(fā)的芽基部為外植體時(shí)，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA3.0-5.0mg/L+NAA0.10mg/L+椰汁10%+蔗糖20g/L+卡拉膠粉9.5g/L，接種60d后，芽的誘導(dǎo)率為0。目前，尚未有對(duì)小花山奈進(jìn)行組織培養(yǎng)種苗生產(chǎn)的報(bào)道。因此，需盡快研發(fā)出一種有效的小花山奈組培快繁方法。

1 材料與方法

1.1 材料

采集小花山奈的根莖用自來(lái)水清洗干凈（圖1-A），剪掉根莖上的須根后，消毒后晾干;再放人洗凈消毒的河沙中，恒溫發(fā)芽（圖1-B）;洗凈根莖芽，取其芽基部。將消毒好的芽基部接種到增殖培養(yǎng)基（MS、6-BA8.0mg/L、NAA0.10mg/L、椰汁10%、蔗糖30g/L、卡拉膠粉9.5g/L）上培養(yǎng)（圖1-C），直至芽基部形成球狀（圖1-D），然后切割增殖的芽基部接種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS、6-BA5.0mg/L、NAA0.10mg/L、椰汁10%、蔗糖30g/L、卡拉膠粉9.5g/L）誘導(dǎo)出叢生芽（圖1-E）。取無(wú)菌苗的芽基部為材料。

1.2 方法

1.2.1 接種材料處理

在超凈工作臺(tái)上，將無(wú)菌苗從瓶中取出，置于消毒的碟子中，用刀片切去葉片、莖和根，只留約1cm的芽基部。每一個(gè)芽基部大小接近，接種于芽基部增殖培養(yǎng)中。

1.2.2 試驗(yàn)配方 芽基部增殖培養(yǎng)。試驗(yàn)了6種芽基部增殖培養(yǎng)基A1～A6，基本成分為MS、白沙糖 30g/L和卡拉膠粉10g/L，pH5.8～6.0，其它成分見(jiàn)表1。培養(yǎng)基滅菌條件125℃，40min，下同。每種增殖培養(yǎng)基接40瓶，每瓶接1個(gè)芽基部。20d后觀測(cè)芽基部增大倍數(shù)、啟動(dòng)率、出芽數(shù)和污染率。啟動(dòng)率/%=（啟動(dòng)的芽基部數(shù)/接種的芽基部總數(shù)）×100%;出芽數(shù)=總芽數(shù)/接種總芽基部數(shù);污染率/%=（污染芽基部數(shù)/接種總芽基部數(shù)）×100%。

叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。試驗(yàn)了6種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B1～B6，基本成分為MS、白沙糖30g/L和卡拉膠粉10g/L，pH5.8～6.0，其它成分見(jiàn)表1。每種接40瓶，每瓶接1個(gè)芽基部。50d后觀測(cè)啟動(dòng)率、出芽數(shù)以及污染率。啟動(dòng)率/%=（啟動(dòng)的芽基部數(shù)/接種的芽基部總數(shù)）×100%;出芽數(shù)一總芽數(shù)/接種時(shí)總芽基部數(shù);污染率/%=（污染芽基部數(shù)/接種總芽基部數(shù)）×100%。

生根培養(yǎng)。繼代叢生芽苗高4～6cm時(shí)，切下接種到生根培養(yǎng)基中，每種生根培養(yǎng)基接種9采用7種生根培養(yǎng)基C1～C7，基本成分為MS、白沙糖30g/L和卡拉膠粉9.5g/L，pH5.8～6.0，其它成分見(jiàn)表1。分別在20d后統(tǒng)計(jì)生根率、單苗平均根數(shù)、根長(zhǎng)和污染率。生根率/%=（生根的芽苗數(shù)胺種芽苗總數(shù)）×100%;單苗平均根數(shù)=總根數(shù)性根苗數(shù);根長(zhǎng)=總根長(zhǎng)性根苗數(shù);污染率/%=（污染芽數(shù)/接種總芽數(shù)）×100%。

1.2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室各階段溫度為25～30℃，光照強(qiáng)度為2000～2300lx，光照時(shí)間控制為14h/d。

1.2.4 組培苗的移栽

取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，0.1%的百菌清溶液浸泡30min，移栽到進(jìn)口泥炭：紅壤：腐葉土（V/V/V=1：1：1）的基質(zhì)中。統(tǒng)計(jì)成活率和觀察長(zhǎng)勢(shì)。成活率/%=（成活的苗數(shù)/種的苗數(shù)）×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用excel 2016整理數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS16.0軟件的One-Way ANOVA模塊進(jìn)行方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 小花山奈芽基部的有效增殖

由表2和圖2可知，經(jīng)20d培養(yǎng)后，不同的6-BA和NAA濃度對(duì)小花山奈芽基部增殖有明顯的影響。啟動(dòng)率低于80%的為A6;啟動(dòng)率在80%～90%的為A2和A4;啟動(dòng)率在90%～100%的為A5、Al和A3，其中A6的啟動(dòng)率顯著低于其它5種培養(yǎng)基。芽基部增大倍數(shù)依次為A3>A1>A5>A2>A4>A6，其中A1和A3顯著大于A5、A2和A4，A1和A3之間差異不顯著;A6顯著低于A5、A2和A4，后三者之間差異不顯著（表2）。由于A3的污染率高（13.33%），A6的啟動(dòng)率低于80%。因此，培養(yǎng)基A1為小花山奈的最佳芽基部增殖培養(yǎng)基;小花山奈的有效芽基部繼代增殖，6-BA的濃度為8.0～10.0mg/L，NAA為0～0.10mg/L。

2.2 小花山奈叢生芽誘導(dǎo)

不同激素濃度對(duì)小花山奈芽基部的叢生芽誘導(dǎo)的影響見(jiàn)表3和圖3。由表3可看出，6種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的啟動(dòng)率均在90%以上;出芽數(shù)依次為B1>B5>B6>B4>B2>B3，其中B1的出芽數(shù)顯著高于B5，B6、B4、B2和B3之間差異不顯著。由圖3可看出，B1培養(yǎng)基可分化出4～5個(gè)叢生芽，葉綠且叢生芽長(zhǎng)勢(shì)好;B4、B5和B6培養(yǎng)基可分化出2～4個(gè)叢生芽;B2和B3培養(yǎng)基可分化出2～3個(gè)叢生芽。因此，小花山奈芽基部的叢生芽的誘導(dǎo)，6-BA的適合濃度為3.0～5.0mg/L，NAA的適合濃度為0.050.10mg/L，其中以6-BA3.0mg/L和NAA0.05mg/L為最佳，有長(zhǎng)勢(shì)好、數(shù)量多的叢生芽

2.3 小花山奈的生根培養(yǎng)

由表4可看出，除C7外，C1～C6培養(yǎng)基的生根率在80%以上，其中平均每株生根數(shù)最多和根長(zhǎng)最長(zhǎng)的為C4培養(yǎng)基，即NAA0.10 mg幾、15%香蕉泥以及1g幾活性炭的培養(yǎng)基。由圖4可看出，C4培養(yǎng)基上苗的根數(shù)最多和根長(zhǎng)最長(zhǎng)。

2.4 小花山奈組培苗移栽

將小花山奈的組培苗洗凈根部培養(yǎng)基，0.1%的百菌清溶液浸泡30min，移栽到進(jìn)口泥炭：紅壤：腐葉土（V/V/V=1：1：1）的基質(zhì)中，濕度控制70%～90%，溫度控制25～32℃，自然光照覆蓋兩層遮陰網(wǎng)，成活率達(dá)85%以上，長(zhǎng)勢(shì)良好，見(jiàn)圖5。

3 討論與結(jié)論

由于姜科植物的多樣性，不同姜科植物的組織培養(yǎng)步驟和培養(yǎng)基也不同。目前，紅姜花、白姜花、海南三七、山奈、土田七、姜黃和芒果姜等姜科植物采用不同的外植體，如未成熟花絲、花藥、莖尖、葉、葉鞘、塊莖芽、幼嫩根莖和根莖芽基部，進(jìn)行了外植體滅菌技術(shù)、離體培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基配方篩選方面的研究，建立了較好的組織培養(yǎng)快繁體系[5-15]。小花山奈的研究集中在藥理成分和光合特性方面[16-17]，其組織培養(yǎng)方面的報(bào)道鮮見(jiàn)。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，取小花山奈塊莖上萌發(fā)的芽基部為外植體時(shí)，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA3.05.0mg/L+NAA0.10mg/L+椰汁10%+蔗糖20g/L+卡拉膠粉9.5g/L，芽的誘導(dǎo)率為0;但取海南三七根莖芽基部為外植體時(shí)，其叢生芽的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10g/L+10%。椰汁[6]。因此，不同的山奈屬植物其組織培養(yǎng)的步驟和培養(yǎng)基也不同。本研究取小花山奈無(wú)菌苗的芽基部為外植體時(shí)，調(diào)整培養(yǎng)基中6-BA和NAA的濃度，采取先增殖芽基部，然后切割增殖的芽基部后，再轉(zhuǎn)移至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，這一過(guò)程可有效誘導(dǎo)叢生芽，可在短期內(nèi)獲得大量性狀穩(wěn)定的小花山奈種苗。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，小花山奈芽基部繼代增殖比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA8.0～10.0mg/L+NAA0～0.10mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉膠粉10g/L，最佳的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA8.0mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉膠粉10g/L;叢生芽誘導(dǎo)比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA3.05.0mg/L+NAA0.05～0.10mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉膠粉10g/L，最佳的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.05mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉膠粉10g/L;生根最佳的培養(yǎng)基為MS+NAA0.10mg/L+香蕉泥15%十活性炭1g/L+白沙糖30g/L+卡拉膠粉9.5g/L。本研究成功建立了小花山奈無(wú)菌苗芽基部的組培快繁體系。

參考文獻(xiàn)

[1]高江云，夏永梅，黃加元，等.中國(guó)姜科花卉[M].北京：科學(xué)出版社，2006：110.

[2]吳德鄰，陳升振，蔡希陶，等.中國(guó)植物志（第十六卷，第二分冊(cè)）[M].北京：科學(xué)出版社，1981：40.

[3]吳德鄰，劉念，葉育石.中國(guó)姜科植物資源[M].武漢：華中科技大學(xué)出版社，2016：109.

[4]李冬梅，趙超藝，劉小飛.施用不同肥料對(duì)扦插紫花山奈生長(zhǎng)和光合作用的影響[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（11）：4-10.

[5]吳繁花，于旭東，李成竹，等.山奈組織培養(yǎng)[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2009，30（3）：338-342.

[6]李冬梅，趙超藝，劉小飛.海南三七根莖芽基部的組培快繁[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（9）：34-37，51.

[7]劉盼盼.兩種姜科花卉的組培快繁及生長(zhǎng)調(diào)控研究[D].廣州：華南師范大學(xué)，2013.

[8]吳丹.三種野生姜科花卉組培快繁體系的建立[D].廣州：華南師范大學(xué)，2014.

[9]Raju Chellappan Soundar，Aslam Abubakker，Kathiravan Krishnan，et al.Direct somaticcmbryogenesisand plant regeneration from leaf sheath explants of mangoginger（Curcuma amada Roxb.）[J].In vitro cellular anddevelopmental biology-plant，2014，50：752-759.

[10]Raju Chellappan Soundar，Aslam Abubakker，ShajahanAppakan.High-efficiency direct somaticcmbryogenesis andplant regeneration from leaf explants of turmeric（Curcumalongs L.）[J].Plant cell tissue and organ culture，2015，122：79-87.

[11]肖望，涂紅艷，張愛(ài)玲.白姜花胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與植株再生體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào)，2016，43（8）：1605-1612.

[12]肖望，涂紅艷，鄧崇會(huì).紅姜花判性細(xì)胞懸浮體系的建立和原生質(zhì)體培養(yǎng)[J].北方園藝，2015（5）：104-108.

[13]潘梅，符瑞侃，黃賽，等.野生姜科植物土田七的外植體滅菌技術(shù)研究[J].中國(guó)野生植物資源，2017，36（3）：23-26.

[14]黃賽，符瑞侃，楊珺，等.土田七的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)報(bào)，2016，52（9）：1347-1352.

[15]李冬梅，趙超藝，劉小飛.土田七幼嫩根莖的組培快[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（10）：45-49.

[16]李冬梅，劉小飛，朱根發(fā).四種山奈屬植物光合特性的比較研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，38（4）：46-51.

[17]Saronya Tuntiyasawasdikul，Ekapol Limpongsa，NapaphakJaipakdee，et al.Transdermal permeation of Kaempferiaparviora methoxyflavones from isopropyl myristate-basedvehicles[J].RAPS PharmSciTech，2014，15（4）：947-955.