孟文建 王自強(qiáng) 于永揚(yáng) 孫曉峰 周總光

大腸癌（colorectal cancer，CRC）包括結(jié)腸癌和直腸癌，是威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)腫瘤之一。在中國(guó)，約70%～75%的直腸癌為中低位直腸癌，手術(shù)是主要的治療手段。然而，即使有了全直腸系膜切除（total mesorectal excision，TME）的手術(shù)方式，但仍30%的局部進(jìn)展期直腸癌患者可能環(huán)周切緣陽(yáng)性，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)［1］。術(shù)前新輔助放療也已成為進(jìn)展期中低位直腸癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，但術(shù)前放療面臨的最大的挑戰(zhàn)是直腸腫瘤對(duì)放療的敏感性存在較大的差異。因此，深入了解腫瘤放射敏感性的機(jī)制，有助于尋找預(yù)測(cè)放療敏感性的分子標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)患者的個(gè)性化篩選。SATB1作為染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)，被稱為“基因組組織者”，它能調(diào)控超過(guò)10%的基因，這些基因的功能復(fù)雜多樣，從而表明SATB1基因的功能多樣性［2］。近年來(lái)，SATB1在腫瘤中的重要作用備受關(guān)注，眾多研究證實(shí)SATB1與喉癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和（或）轉(zhuǎn)移有關(guān)［3-7］。我們前期的研究結(jié)果［8］首次證實(shí)SATB1表達(dá)與直腸癌的進(jìn)展有關(guān)。除了在腫瘤中的重要作用外，SATB1在治療方面的價(jià)值，特別是對(duì)放化療的反應(yīng)性，日益受到人們的關(guān)注。本研究通過(guò)分析SATB1表達(dá)與預(yù)后及放療相關(guān)因子的關(guān)系，探討SATB1在直腸癌新輔助放療中的作用。

資料與方法

一、一般資料

本研究選取142例參與瑞典術(shù)前放療研究（Stockholm Trial I）的直腸癌患者作為研究對(duì)象，其中68例接受術(shù)前短程放療（5 Gy/次，共25 Gy）（RT組），74例未接受術(shù)前放療（non-RT組），包括直腸癌組織（n=142）和相應(yīng)的正常黏膜組織（n=107）、術(shù)前活檢癌組織（n=84）以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（n=43）。所有患者無(wú)局部手術(shù)或化療病史，且術(shù)前經(jīng)影像學(xué)檢查排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其中男性80例，女性62例。年齡37～75（中位年齡57歲）。放療結(jié)束1周后手術(shù)，患者新輔助放療前活檢及術(shù)后切除腫瘤組織、正常組織以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)確診。兩組患者的基線特征無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表1）。中位隨訪期為75個(gè)月（0～193個(gè)月）。本研究得到了瑞典和四川大學(xué)倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 患者及腫瘤的臨床病理特征

二、免疫組織化學(xué)染色

收集的直腸癌組織和相應(yīng)的正常黏膜組織、術(shù)前活檢癌組織以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，使用手動(dòng)點(diǎn)樣儀（英國(guó)Beecher公司）構(gòu)建組織芯片。從每個(gè)切片中選取3個(gè)形態(tài)學(xué)上有代表性的區(qū)域，并從中取3條柱形中心組織（直徑0.6 mm）包埋進(jìn)蠟塊中，使用顯微薄片切片機(jī)5 um厚度切片，固定于載玻片。將組織芯片置于二甲苯脫蠟、乙醇再水化，然后雙蒸水洗滌。使用高壓鍋在125℃沸水中抗原修復(fù)切片30 s，置于1×DIVA緩沖液中煮沸（125 ℃，30 s），自然冷卻20 min以上，至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min。切片經(jīng)3%過(guò)氧化氫-甲醇液孵育5 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS沖洗后，正常羊血清工作液37 ℃封閉10 min，傾去勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的兔抗-SATB1單克隆抗體（1：250；Epitomics），4℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5 min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）。滴加生物素標(biāo)記的二抗（Dakocytomation）37 ℃孵育25 min，PBS沖洗。滴加DAB顯色2～10 min，顯微鏡下觀察，有棕黃色沉淀物，即自來(lái)水沖洗，終止反應(yīng)。最后，蘇木素復(fù)染3～5 min，鹽酸酒精分化1～2 s，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

三、免疫組化結(jié)果判定

使用奧林巴斯DD70BX51采集圖像，細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。于高倍顯微鏡（×400）下，每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞，取其平均值。根據(jù)染色的強(qiáng)度及切片陽(yáng)性細(xì)胞率判斷結(jié)果，染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分和棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞率：無(wú)為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。上述兩項(xiàng)指標(biāo)相乘后獲得總評(píng)分0～9分：0分為陰性，1～2分為弱，3～6分為中，7～9分為強(qiáng)。由2個(gè)研究者獨(dú)立進(jìn)行閱片和評(píng)分，總評(píng)分為陰性或弱者為弱表達(dá)，總評(píng)分為中和強(qiáng)的病例為強(qiáng)表達(dá)。

四、放療相關(guān)因子的表達(dá)

我們以前在本研究使用的這些標(biāo)本中采用免疫組化染色檢測(cè)了一些與放療有一定相關(guān)性的指標(biāo)，包括 Necrosis（n=134）［9］、Ki-67（n=114）［10］、p53（n=134）［11］、p73（n=120）［12］、ATM（n=168）［13］、FXYD-3（n=123）［14］、pRb2/p130（n=80）［15］、MAC30（n=115）［16］、TEM1（n=119）［17］和Survivin（n=89）［18］。

五、網(wǎng)絡(luò)分析

通 過(guò) Ingenuity通 路 分 析（IPA，Ingenuity?Systems，Mountain View，CA；www.ingenuity.com）評(píng)估SATB1的功能重要性。將相互作用基因（包括SATB1）的基因銀行ID上傳到IPA，然后IPA將其映射至Ingenuity通路知識(shí)庫(kù)（IPKB）中的功能性網(wǎng)絡(luò)。與整個(gè)IPKB進(jìn)行對(duì)比，分配給焦點(diǎn)基因功能的生物學(xué)功能構(gòu)成了網(wǎng)絡(luò)。

六、蛋白-蛋白相互作用分析

蛋白-蛋白相互作用分析用于發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)之間的可能相互作用。首先從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)下載SATB1（UniProt ID：Q01826），pRb2/p130（UniProt ID：Q08999）和TEM1（UniProt ID：Q9HCU0）的氨基酸序列，然后將這些序列呈遞給I-TASSER服務(wù)器并下載計(jì)算出來(lái)的最優(yōu)模型。C-評(píng)分最好在2到-1.5。然后獲得的結(jié)構(gòu)在NIH-SAVES服務(wù)器上進(jìn)行驗(yàn)證并呈遞給Z-DOCK服務(wù)器以獲得相互作用模型。在Swiss-PDB閱讀器里，每個(gè)蛋白和復(fù)合物的能量被最小化。最后在Swiss-PDB閱讀器中計(jì)算出復(fù)合物和每個(gè)獨(dú)立鏈的能量，并從兩個(gè)蛋白的能量之和中減去復(fù)合物能量來(lái)評(píng)分結(jié)合的自由能。從POPS服務(wù)器計(jì)算每個(gè)蛋白和復(fù)合物的可及表面積（ASA），然后從每個(gè)蛋白ASA之和中減去復(fù)合物ASA來(lái)計(jì)算ΔASA。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)或確切概率法檢驗(yàn)，SATB1與總生存期（overall survival，OS）、無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS）以及復(fù)發(fā)的關(guān)系采用Cox回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SATB1在不同組織中的表達(dá)情況

在未接受術(shù)前放療的患者中，SATB1從正常組織（16/68；24%）到原發(fā)腫瘤（31/74；42%）表達(dá)升高（χ2=5.396，P=0.032），而從腫瘤到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（4/27；15%）表達(dá)降低（χ2=6.405，P=0.022，圖1A）。在接受術(shù)前放療的患者中，SATB1在正常黏膜（12/61；20%）、原發(fā)腫瘤（14/68；21%）以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（3/16；19%）中的表達(dá)差異無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖1B）。

圖1 SATB1在直腸癌患者中的表達(dá)情況。1A：在未接受術(shù)前放療的患者中，SATB1從正常組織到腫瘤表達(dá)升高，而從腫瘤到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)降低（*P＜0.05）；1B：在接受術(shù)前放療的患者中，SATB1從正常組織、腫瘤到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)無(wú)明顯變化

二、SATB1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

在接受術(shù)前放療的患者中，SATB1的表達(dá)與不良的OS（P=0.015）和DFS（P=0.021，圖2A、2B）相關(guān)，獨(dú)立于性別、年齡、TNM分期和腫瘤分化程度（OS：HR，0.516；P=0.039；95% CI：0.274～0.969；DFS：HR，0.558；P=0.025；95% CI：0.335～0.930，表2）。然而，SATB1表達(dá)與局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P=0.261，P=0.056；圖2C、2D）。在未接受放療的患者中，單因素及多因素分析均顯示SATB1表達(dá)與預(yù)后無(wú)關(guān)。這些結(jié)果提示SATB1表達(dá)可以獨(dú)立用于預(yù)測(cè)接受術(shù)前放療直腸癌患者的預(yù)后。

三、放療對(duì)腫瘤組織中SATB1表達(dá)的影響

與未放療的直腸癌組織比較，放療后SATB1表達(dá)明顯下降（42% vs. 21%，P=0.011）；放療后SATB1在腫瘤組織中的表達(dá)低于術(shù)前活檢癌組織（40% vs. 20%，P=0.042，圖3）。

四、SATB1與放療相關(guān)因子的關(guān)系

我們將以前采用相同放療標(biāo)本檢測(cè)的一些放療有關(guān)因子（包括ATM、FXYD-3、MAC30、pRb2/p130、Ki-67、Survivin等）的數(shù)據(jù)，與SATB1表達(dá)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示在這些放療的直腸癌患者中，腫瘤組織中SATB1高表達(dá)，與ATM和pRb2/p130低表達(dá)（χ2=5.427，P=0.032；χ2=4.610，P=0.047），而與Ki-67和TEM1表達(dá)均需一致（χ2=4.339，P=0.037；χ2=7.376，P=0.014），見(jiàn)表 3。最后，我們通過(guò)Ingenuity通路分析（IPA）分析SATB1與這些放療相關(guān)因子的可能網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，顯示這些蛋白可能通過(guò)一些放療反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路（圖4），比如NF-κB通路、BRCA1介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)通路以及細(xì)胞周期調(diào)控的G1/S檢測(cè)點(diǎn)通路，從而在放療反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。進(jìn)一步，我們檢測(cè)了SATB1蛋白與TEM1和pRb2/p130蛋白的相互作用。結(jié)果顯示SATB1-TEM1和SATB1-pRb2/p130復(fù)合物的ΔASA分別為4513.4 ?2和4286.3?2，結(jié)合自由能分別是-432.18 kcal/mol和-637.482 kcal/mol。在SATB1-TEM1復(fù)合物內(nèi)有8個(gè)氫鍵（圖5A），而SATB1-pRb2/p130復(fù)合物有17個(gè)氫鍵（圖5B）。這些復(fù)合物以極性界面為主要特征，表明這些復(fù)合物非強(qiáng)制性的結(jié)合本質(zhì)。

圖2 接受術(shù)前放療直腸癌患者中SATB1表達(dá)與生存和復(fù)發(fā)的關(guān)系。2A：OS；2B：DFS；2C：局部復(fù)發(fā)；2D：遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

表2 接受術(shù)前放療直腸癌患者OS和DFS的多因素分析

討 論

目前，術(shù)前放療已經(jīng)作為進(jìn)展期直腸癌綜合治療的重要組成部分，均推薦對(duì)局部晚期直腸癌給予術(shù)前放療［19-20］。術(shù)前放療面臨的最大的挑戰(zhàn)是進(jìn)展期直腸癌對(duì)放療的敏感性存在較大的差異，因此找到預(yù)測(cè)放療敏感性的標(biāo)記物可以說(shuō)是走向直腸癌個(gè)體化治療的關(guān)鍵一步［21］。

SATB1作為染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)，在染色體重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、胸腺發(fā)育、T淋巴細(xì)胞成熟等方面發(fā)揮重要的作用［22-25］。SATB1能將多個(gè)遠(yuǎn)程靶序列固定在“蛋糕樣”網(wǎng)絡(luò)中并使它們聚集在一起，形成染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)，并將染色質(zhì)重構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子招募給靶基因，從而在T細(xì)胞中行使遠(yuǎn)程的基因表達(dá)調(diào)控子的功能［25-27］。SATB1能調(diào)控超過(guò)10%的基因，這些基因的功能復(fù)雜多樣，從而表明SATB1基因的功能多樣性。眾多研究證實(shí)SATB1與喉癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和（或）轉(zhuǎn)移有關(guān)［3-7］。我們前期的研究結(jié)果［8］首次證實(shí)SATB1表達(dá)與直腸癌的進(jìn)展有關(guān)。本研究中，在未接受術(shù)前放療的患者中，SATB1從正常組織到原發(fā)腫瘤表達(dá)升高，而從原發(fā)腫瘤到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)降低，顯示SATB1在直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

圖3 術(shù)前放療對(duì)直腸腫瘤SATB1表達(dá)的影響 圖4 網(wǎng)絡(luò)分析。SATB1分子網(wǎng)絡(luò)示意圖。在網(wǎng)絡(luò)中，結(jié)代表蛋白，線代表蛋白間的聯(lián)系。紅色的結(jié)表示上調(diào)，綠色的結(jié)表示下調(diào)，結(jié)的形狀代表蛋白的分子類(lèi)型圖5 蛋白-蛋白相互作用分析。5A：SATB1（淺綠色）與TEM1（青色）復(fù)合物的可能構(gòu)象；5B：SATB1（淺綠色）與pRb2/p130（青色）復(fù)合物的可能構(gòu)象；彩球代表氫鍵

表3 接受術(shù)前放療的直腸癌患者SATB1表達(dá)與生物學(xué)因子的關(guān)系（例，%）

除了在腫瘤中的重要作用外，SATB1在治療方面的價(jià)值，特別是對(duì)放化療的反應(yīng)性，日益受到人們的關(guān)注。DNA是放射線作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，DNA損傷與修復(fù)之間此消彼長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)關(guān)系是影響腫瘤放療敏感性的關(guān)鍵因素。一些DNA損傷和修復(fù)相關(guān)的基因，也是SATB1調(diào)控的靶基因，如DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4（DDIT4）、DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)介質(zhì)1（MDC1）、復(fù)制因子C4（RFC4）、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1（PARP1）、TREX2、染色質(zhì)組裝因子1A（CHAF1A）等［28］。SATB1在T細(xì)胞中介導(dǎo)DNA損傷位點(diǎn)的裝配，SATB1結(jié)構(gòu)體系可在基因調(diào)控時(shí)為染色質(zhì)/轉(zhuǎn)錄因子的重建提供平臺(tái)。Li等［29］發(fā)現(xiàn)在低劑量X射線所致的DNA損傷時(shí)，SATB1能招募DNA修復(fù)蛋白，顯示其在DNA損傷修復(fù)中的重要作用。本研究結(jié)果顯示在接受術(shù)前放療的患者中，SATB1的表達(dá)與這些患者不良的生存獨(dú)立相關(guān)，與局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。提示SATB1表達(dá)可以獨(dú)立用于預(yù)測(cè)接受術(shù)前放療直腸癌患者的預(yù)后。進(jìn)一步，我們比較了放療后SATB1的表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示與未放療的直腸癌組織比較，放療后SATB1表達(dá)明顯下降；同樣，放療后SATB1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于術(shù)前活檢癌組織。提示在放療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞在啟動(dòng)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、DNA損傷修復(fù)等復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，也出現(xiàn)了SATB1表達(dá)的降低，可能在于放療通過(guò)降低SATB1表達(dá)觸發(fā)了其下游調(diào)控機(jī)制，通過(guò)靶基因的調(diào)節(jié)來(lái)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的反應(yīng)性。

理論上，放療可誘導(dǎo)多種多樣基因的轉(zhuǎn)錄，因此調(diào)制基因表達(dá)被認(rèn)為有助于細(xì)胞放射反應(yīng)。這樣，放療誘導(dǎo)的基因表達(dá)可構(gòu)成對(duì)放療的適應(yīng)性或保護(hù)性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。因此，我們將以前采用相同標(biāo)本檢測(cè)的一些放療有關(guān)因子的數(shù)據(jù)，與SATB1表達(dá)進(jìn)行比較，以探究SATB1在直腸癌放療反應(yīng)中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在放療的直腸癌患者中，腫瘤組織中SATB1的表達(dá)與ATM和pRb2/p130表達(dá)負(fù)相關(guān)，而與Ki-67和TEM1表達(dá)正相關(guān)。近來(lái)的研究顯示乳腺癌許多與腫瘤發(fā)生各個(gè)方面有關(guān)的基因，包括ATM、Survivin和pRb2/p130，均受SATB1表達(dá)的調(diào)控。另外，SATB1可直接或間接調(diào)控其靶基因，而在肝癌和結(jié)直腸癌中這些靶基因與乳腺癌中的許多靶基因相互重疊［30-31］。因此，SATB1在直腸癌中有可能像在乳腺癌中那樣影響同一類(lèi)基因。這些相關(guān)的結(jié)果指向一個(gè)機(jī)制，即在放療中這些基因可能以SATB1-依賴的方式受到調(diào)控。隨后，我們采用IPA從IPKB構(gòu)建SATB1調(diào)控蛋白的網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果證實(shí)了SATB1與這些放療反應(yīng)蛋白之間的直接相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)顯示這些蛋白可能通過(guò)一些放療反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路，比如NF-κB通路，BRCA1-介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)通路以及細(xì)胞周期調(diào)控的G1/S檢測(cè)點(diǎn)通路，從而在放療反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。在這些網(wǎng)絡(luò)中，Ki-67被上調(diào)，而ATM和pRb2/p130被SATB1下調(diào)，這與我們研究結(jié)果中SATB1和這些生物學(xué)因子的關(guān)系是一致的。另外，網(wǎng)絡(luò)也顯示SATB1通過(guò)其他通路上調(diào)ATM。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，未觀察到SATB1與TEM1的直接聯(lián)系，這可能在于這種關(guān)系尚未被報(bào)道，而IPA是基于發(fā)表文獻(xiàn)中的信息來(lái)搜索分子間聯(lián)系的。在一個(gè)隨機(jī)選擇基因座（包含SATB1-上調(diào)和下調(diào)基因）的研究中，所有體內(nèi)結(jié)合SATB1均位于其預(yù)測(cè)的堿基解配對(duì)區(qū)，而那些不依賴于SATB1的基因均不與SATB1結(jié)合，即使這些基因座有多個(gè)堿基解配對(duì)區(qū)［32］。因此，我們通過(guò)蛋白-蛋白相互作用分析來(lái)檢測(cè)SATB1與TEM1和pRb2/p130的相互作用，以驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)分析中所檢測(cè)的聯(lián)系。蛋白-蛋白相互作用預(yù)測(cè)是一個(gè)聯(lián)合生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的領(lǐng)域，試圖證實(shí)和分類(lèi)蛋白對(duì)或蛋白組之間的物理相互作用。這些相互作用的信息可提高我們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)，并能為新的治療方法提供理論基礎(chǔ)。ΔASA代表復(fù)合物和單個(gè)分子在水中的差異，為蛋白-蛋白的幾何契合提供信息。事實(shí)上，高ASA是分子間更高的形態(tài)互補(bǔ)的征象。而且，所觀察到的自由結(jié)合能也支持復(fù)合物的穩(wěn)定形成。這些特征顯示SATB1與這些蛋白的結(jié)合可能性。雖然這些相互作用僅僅是預(yù)測(cè)的結(jié)果，但本研究中蛋白-蛋白的相互影響是基于共表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)特征和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，這些證據(jù)是非常充分的。