王 虹，劉 鑫，鄒曉霜，李佳妮，王 歡，齊寶坤，王中江，江連洲

(1黑龍江珍選食品有限公司，哈爾濱 150060；2東北農業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030)

風味肽具有加工性良好、易被消化吸收，并兼具有某些特定生理活性等諸多優(yōu)點，其中鮮味肽在保有其他味覺條件不被破壞的情況下，還可提升各自的呈味風味，所以鮮味肽在菜、乳、肉等食材增味方面具有突出效果[1-3]。目前，我國研制的復合調料存在食用品質差、風味失真等缺陷[4]。本試驗利用定向分段酶解技術酶解鮮味原料底物，即沙丁魚及對蝦[5]，經前階段試驗已探究出復合蛋白酶初步酶解最優(yōu)工藝，即復合蛋白酶加酶量3.3%、溫度57℃、酶解時間3.5h、pH7.1，將蛋白較充分地水解成肽片段，結構更為松散后，再加入風味復合酶實現第二階段的酶解[6]，如此可在保證傳統(tǒng)鮮味的同時，提高蛋白質得率，便于人體吸收。采用單因素試驗及響應面法，以優(yōu)化風味蛋白酶添加量、酶解時間、溫度及pH等工藝，最終確定定向分段酶解條件，并以對蝦及沙丁魚水解液為原料與其他調味原料復配，開發(fā)新型海鮮調味料[7]，為研發(fā)新型高鮮、高香以及高營養(yǎng)特性的海鮮復合調味品開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1材料 對蝦、沙丁魚，市售；復合蛋白酶，諾維信(中國)投資有限公司；濃硫酸、硼酸 、TCA、NaOH、CuSO4·5H2O、K2SO4、甲基紅、溴甲酚綠，上海凌峰化學試劑有限公司；酶解液、葡萄糖、白砂糖、食鹽、醬油、海藻酸鈉、淀粉、生姜粉，均為食品級。

1.1.2儀器與設備 Mettler Toledo分析天平，上海衡平有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋，上海一恒有限公司；F-4500型熒光分光光度計，日本Hitachi公司；GL-25MS 超速高速冷凍離心機，上海盛析儀器設備有限公司；超濾裝置，無錫賽普膜科技發(fā)展有限公司；KND2C型定氮儀，上海纖撿儀器有限公司；數顯臺式酸度計，上海浦春計量儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)干燥儀，上海亞榮有限公司；PF6原子熒光儀、TSA-986 原子吸收儀，北京普析有限公司；FDU-1200冷凍干燥機，日本東京Rikakikai公司；L-8900氨基酸分析儀，日本日立高科技有限公司；Mersham蛋白質純化系統(tǒng)，美國曼德公司；Superdex peptide 10/300 GL分析柱，美國上海諾磁公司。

1.2 試驗方法

1.2.1酶解提肽方法 前期階段添加復合蛋白酶酶解[8]，將蛋白顆粒先被水解為肽片段，酶解條件：復合蛋白酶加酶量3.3%、溫度57℃、酶解時間3.5h、pH7.1。結構松散后，離心得上清液，再加入風味復合酶實現第二階段的酶解，去除苦味肽，離心后取上清液即為酶解成品。分段酶解技術不僅提高多肽得率，同時增加氨基酸含量，使鮮味更加濃郁。

1.2.2酶解工藝流程[9-10]原料→解凍→粉碎→蝦魚漿→混合液→復合蛋白酶水解→滅酶→離心→過濾→取上清液→風味蛋白酶水解→滅酶→離心→過濾→取上清液→成品

1.2.3基本指標測定 總氮量依據GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》方法測定[11]，氨基態(tài)氮含量根據ZBX 66038—1987《基態(tài)氮測定法》方法進行測定[12]。水解度的測定如式(1)所示，用以表征底物蛋白中被水解肽鍵數占肽鍵總數的百分含量[13]。

(1)

1.2.4響應面試驗設計 針對采用風味酶對鮮味肽進行二次酶解試驗中，以各酶解工藝參數酶解溫度x1(℃)、酶解pH x2、酶解時間x3(h)、酶添加量x4(%)作自變量，鮮味肽水解率作響應值(表1)。

表1 因素水平編碼

1.2.5酶解液多肽分子量分布 取離心后酶解液上清液，通過Amersham 蛋白純化系統(tǒng)，Superdex peptide 10/300 GL分析柱，在洗脫液0.25 mol/L氯化鈉、0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液、pH 7.2、進樣體積50 μL、檢測波長214 nm、流速0.5 mL/min條件下[14]，進行酶解液多肽分子量分布測定。

1.2.6酶解液氨基酸分析[15]將定量樣品移至水解管內，添加6 mol/L HCl，抽真空后并封管。于水解器中在110°C條件下水解24h。定容后進行過濾操作，對所得濾液加以干燥使其成固態(tài)，隨后試樣溶解于0.02 mol/L HCl并調整至適合的濃度，使用氨基酸分析儀進行氨基酸類型及組成成分測定[16-17]。

1.2.7酶解液美拉德反應 取分子量不同的酶解組分樣品1.5 g，依次添加1.5 g葡萄糖、0.3 g食用姜粉、0.3 g NaCl、蒸餾水10 mL，加溫至115°C后加熱0.5h以開始美拉德反應，反應結束停止后即刻冷卻樣品至室溫。隨后用蒸餾水將反應溶液稀釋到適宜濃度，留待感官評價[18]。

1.2.8調味料配方[19]以酶解濃縮液為基料，添加白砂糖、食鹽、味精、淀粉(食品級)等輔料制備混合調味料。

1.2.9數據分析 每組試驗重復3次，試驗數據使用SigmaPlot 12.5軟件繪制趨勢曲線圖。

2 結果與分析

2.1 風味蛋白酶酶解條件確定

通過單因素試驗對風味蛋白酶的時間、酶添加量、pH及酶解溫度等工藝條件進行優(yōu)化，以確定風味蛋白酶酶解的最適工藝參數。

2.1.1風味蛋白酶酶解單因素試驗

(1)加酶量對酶解效果的影響：由圖1可知，pH調整至7、酶解時間1 h、酶解溫度50°C時，水解度的變化趨勢為先升高后降低。加酶量為1%時水解度最高。(2)酶解時間對酶解效果的影響：由圖2可知，pH調整至7、酶添加量1%、酶解溫度50℃時，水解度的變化趨勢為先上升后下降。時間為2 h時水解度最高。(3)pH對酶解效果的影響：由圖3可知，在酶解溫度50℃、酶解時間1h、酶添加量1%，水解度的變化趨勢為先上升后下降。pH為7時水解度最高。(4)溫度對酶解效果影響：由圖4可知，調整pH至7、酶解時間1 h、酶添加量1%，水解度的變化趨勢呈先上升后下降。其中，酶解溫度50°C時蛋白水解程度最大。

圖1 加酶量對酶解效果的影響

圖2 酶解時間對酶解效果的影響

圖3 pH對酶解效果的影響

圖4 溫度對酶解效果影響

2.1.2風味蛋白酶酶解響應面試驗結果

(1)風味蛋白酶酶解鮮味肽響應面試驗：以單因素試驗為基礎，依照Box-Behnken響應面法的試驗要求，開展多組試驗(表2)。采用Design Expert軟件分析，將溫度、pH、酶解時間及酶添加量作響應變量，以水解率作響應值進行回歸分析，得到預測模型如式(2)：

Y=63.51+1.85X1+2.46X2-2.76X3-3.68X4+4.98X1X2+0.50X1X3-0.22X1X4+1.92X2X3+2.81X2X4-3.08X3X4-5.39 X12-5.75X22-2.54X32-5.27X42

(2)

表2 響應方案及結果

表3 回歸與方差分析結果

(2)因素間的交互作用：根據表3可得，交互項x1×x2對鮮味肽水解率影響極顯著，重點分析交互項AB對水解度(Y)的影響，固定模型中的酶解時間x3=2h和加酶量x4=1%，x1×x2交互作用的三維曲面圖與等高線圖見圖5。

圖5 交互項x1×x2對水解度的影響

2.2 酶解液成分的測定

2.2.1酶解液中多肽分子量分布的測定結果 由圖6～7可見，一次酶解液中多肽主要集中在3 000～5 000 Da以上，占到44.15%，大于10 000 Da肽段的比例最低，為4.67%。相比一次酶解液，二次酶解液中分子量大于5 000Da的肽段比例顯著降低，1 000～3 000 Da肽段比例最大，可見，通過二次酶解能較好地降解大分子量的片斷。酶解液通過二次酶解后，產物中分子量小于5 000 Da 的肽段比例顯著提高，酶解產物中肽段分子量主要分布在1 000～3 000 Da及3 000～5 000 Da這兩部分，占總肽段的比例為88.2%。

綜上所述，通過復合酶水解能較好地降解海鮮中分子量大于10 000 Da的片斷，酶解產物中分子量主要分布在3 000～5 000 Da，而經過風味蛋白酶進行二次酶解后，其中分子量大多分布于1 000～3 000 Da內。目前研究人員分離得到的鮮味肽也主要是分子量介于3 000Da以下的寡肽，可見，兩次酶解液的肽分子量分布特點證明，二次酶解有助于酶解更加充分，使大分子量的肽分解成寡肽的轉化率更高，更有助于鮮味的體現。

圖6 一次酶解液的肽分子量分布

圖7 二次酶解液的肽分子量分布

2.2.2最佳條件下酶水解液中氨基酸的含量測定

(1)復合蛋白酶水解液中氨基酸的含量：以復合蛋白酶酶解后樣品中氨基酸量為參照，以其中氨基酸含量對后續(xù)試驗中風味酶解對氨基酸的影響進行比對考察(表4)。(2)復合蛋白酶與風味蛋白酶分段酶解液中氨基酸含量：比對表4，參照表5可知，雙酶水解后的水解液中，各種氨基酸的含量均有較顯著提升。大量氨基酸是進行美拉德反應的先決條件，可見雙酶解試驗后不但能改善產品風味，還能大量提取初次水解液中的氨基酸，試驗效果十分顯著。

表4 復合蛋白酶解液中各種氨基酸的含量

表5 分段酶解液中各種氨基酸的含量

2.2.3美拉德驗證風味試驗 通過初次水解液及風味酶二次水解液的美拉德反應，判斷對比其最終風味。從表7可以看出，單一酶水解得到的水解液經美拉德反應后烤魚味一般，呈現苦腥味；而經復合及風味蛋白酶二次水解后的水解液感官上均好過僅經單一酶水解的樣品，故經復合蛋白酶及風味蛋白酶二次水解是必要的。

表6 美拉德反應感官評定

2.2.4調味料的制備 以酶解液為基料，按照以下配方進行調配：酶解液100 mL、白糖8 g、食鹽4 g、醬油14 mL、淀粉7.5 g、海藻酸鈉0.05 g、姜汁3 mL、香油2 mL，加熱濃縮至一定稠度后即可制備出具有海鮮風味的復合調味料。該產品呈半流體狀、味道鮮美、口感天然，具有海產品特有香氣，其產品質量指標見表7。

表7 復合調味料質量指標

3 結論

試驗選擇對蝦及沙丁魚作原材料，利用復合蛋白酶及風味蛋白酶雙酶定向分段酶解手段生產高附加值鮮味提升肽，充分實現了對水產資源的高效利用。在采用復合蛋白酶初步水解基礎上，確定風味蛋白酶二次酶解生產鮮味肽的最佳工藝參數：溫度51℃、pH 7.1、酶解時間1.9h、酶添加量1.0%，該條件下實現的雙酶解工藝使得水解率高達64.24%。相較于初次酶解，風味酶的二次水解能夠顯著提升酶解液內氨基酸含量，且二次水解液經美拉德反應后質量也明顯優(yōu)于初次水解液。以二次水解液為基料開發(fā)海鮮調味料，產品風味宜人，工藝簡便且不需添加味精或其他鮮味劑，口味自然，具有較樂觀的開發(fā)前景及市場預期。◇