喬?？?周樹虎 鄭培兵 齊子有 邢春葉 石其光 郝延磊

吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)是以周圍神經(jīng)和神經(jīng)根的脫髓鞘病變及小血管炎性細胞浸潤為病理特點的自身免疫性周圍神經(jīng)病，其病因和發(fā)病機制仍不明確[1]。免疫球蛋白和血漿置換治療GBS有效，但由于其價格昂貴，限制了其臨床應用。流行病學資料顯示，免疫球蛋白和血漿置換僅對65%的GBS患者有效，約2%～12%的患者因療效差而死亡，另有7%～15%的患者會遺留有嚴重殘疾[2]，給社會和患者家庭帶來沉重負擔。因此尋找經(jīng)濟有效的GBS治療方法具有重要意義。

Reid-Adam等[3]首次發(fā)現(xiàn)，瞿麥可顯著抑制幼稚性和記憶性自身反應性T細胞增殖和分泌γ干擾素(IFN-γ)的作用，并能促進調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)增殖，而Treg數(shù)量的增加可促進GBS的疾病恢復。因此，作者推測瞿麥極有可能具有治療GBS的作用。目前，對于瞿麥調(diào)控免疫細胞分化的機制尚不明確，有關瞿麥治療自身免疫性疾病的研究尚未檢索到。本研究利用人工合成的P0180-199肽段混以完全福氏佐劑(CFA)主動免疫C57BL/6小鼠建立實驗性自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)模型，觀察瞿麥對EAN小鼠臨床癥狀、Th細胞亞群、炎性細胞因子的影響，旨在探討瞿麥是否具有治療GBS等自身免疫性疾病的作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物6周齡C57BL/6雄性小鼠16只，體質(zhì)量20～24 g，所用小鼠符合SPF級標準并飼養(yǎng)于標準級SPF級動物房中。將小鼠隨機分為瞿麥組和對照組，每組8只。本實驗已通過濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理審查。

1.2主要試劑和儀器中藥瞿麥購于濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房，按常規(guī)包煎制成1 g/mL的水煎劑，濃縮成3 g/mL。P0180-199肽段購自上海生工公司，CFA購自美國Sigma公司，百日咳毒素干粉購自北京生物制品研究所，胎牛血清、1640培養(yǎng)基、100×青鏈霉素均購自美國Gibio公司，F(xiàn)ITC Anti-mouse CD4抗體、APC Anti-mouse CD25抗體、PE Anti-mouse Foxp3抗體、PE Anti-mouse IFN-γ抗體、APC Anti-mouse IL-4抗體、PE Anti-mouse IL-17F抗體均購自美國e-Bioscience公司，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL-1β)和IFN-γ ELISA試劑盒均購自武漢博士德有限公司。流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，酶標儀為美國ChroMate?Microplate Reader。

1.3方法

1.3.1EAN造模方法：25 μL生理鹽水中加入50 μg P0180-199，25 μL CFA加入0.5 mg結(jié)核分支桿菌，用針式混勻器混勻制成油包水，兩者混合溶液經(jīng)小鼠肩胛區(qū)皮下注射，分別在第0天、第8天免疫小鼠兩次誘導EAN模型。所有小鼠在免疫前1天以及免疫后第1天和第3天經(jīng)尾靜脈分別注射400、300、300 ng百日咳毒素[4]。造模后，每天由專人進行臨床評分，觀察各小鼠的行為學表現(xiàn)并記錄評分變化情況。觀察期自初次免疫后持續(xù)至免疫后28 d。行為學評分采用如下標準：0分：正常；0.5分：介于正常和臨床癥狀之間；1分：尾部無力；2分：出現(xiàn)后肢癱；3分：出現(xiàn)明顯的后肢癱；4分：四肢癱瘓；5分：死亡。小鼠臨床行為學評分達2分時進行治療干預。

1.3.2瞿麥治療干預方案：按體質(zhì)量15 g/kg給予瞿麥組小鼠瞿麥灌胃，1次/d，連續(xù)1周。對照組以相同方式給予同等劑量的生理鹽水。

1.3.3外周血Th1/Th2/Th17/Treg細胞水平檢測：于免疫后第28天，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，經(jīng)頸靜脈抽取外周血后分離淋巴細胞，每個流式管取外周血淋巴細胞1×106個，然后分別用FITC標記的CD4、Foxp3、IFN-γ，IL-4、PE、IL-17F抗體進行流式細胞儀檢測Th1、Th2、Th17、Treg細胞水平并計算Th1/Th2和Th17/Treg比值，所有實驗步驟操作參照說明書進行。

1.3.4TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平檢測：免疫后第28天，經(jīng)頸靜脈抽取外周血后應用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平。所有實驗步驟操作參照說明書進行。通過標準品制作標準曲線，根據(jù)樣品吸光度值計算各樣品的實際濃度，單位以pg/mL表示。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1EAN小鼠造模情況絕大多數(shù)小鼠于免疫后第7天開始出現(xiàn)精神不振等非特異性表現(xiàn)，第9天開始發(fā)病，出現(xiàn)尾部無力、活動受限等臨床表現(xiàn)，臨床行為學評分均在2分以上。所有小鼠EAN造模成功。

2.2各組EAN小鼠行為學評分比較同對照組相比，瞿麥組小鼠行為評分的高峰期明顯延遲(對照組在第17天，而瞿麥組在第19天)，瞿麥組最高評分較對照組降低(4.75±0.46比3.75±0.88；t=2.828，P=0.013)，且第28天時其評分依然低于對照組(0.44±0.42比1.06±0.68；t=2.220，P=0.043)。結(jié)果見圖1。

注：EAN：實驗性自身免疫性神經(jīng)炎，圖1、表1～2同；與瞿麥組比較，aP<0.05 圖1 兩組EAN小鼠行為學評分比較

2.3兩組EAN小鼠Th細胞亞群分化比較與對照組相比，瞿麥組外周血單個核細胞中CD4+IL-17+(Th17)細胞和CD4+Foxp3+(Treg)細胞水平以及Th1/Th2和Th17/Treg細胞比值降低(P<0.01或P<0.05)，而CD4+IFN-γ+(Th1)細胞、CD4+IL-4+(Th2)細胞未發(fā)生統(tǒng)計學變化(均P>0.05)。結(jié)果見圖2和表1。

2.4兩組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平比較與對照組相比，瞿麥組EAN小鼠血清TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平明顯下降(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果見表2。

圖2 流式細胞儀檢測兩組EAN小鼠外周血Th細胞亞群水平

表1 兩組EAN小鼠外周血Th細胞亞群及Th1/Th2和Th17/Treg細胞比值(n=8，±s)

注：a數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示

表2 兩組 EAN小鼠血清TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平比較(n=8，±s，pg/mL)

注：TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白細胞介素-1β；IFN-γ：γ干擾素

3 討論

探討GBS患者免疫耐受失衡的具體機制，將有助于了解其發(fā)病機制，進而尋找治療自身免疫性疾病的臨床干預方法。EAN是目前研究GBS的經(jīng)典動物模型，通過利用優(yōu)勢肽段P0或P2加CFA主動免疫易感動物而建立，其臨床表現(xiàn)、電生理表現(xiàn)以及免疫學特征與GBS相似，因此廣泛被用于研究GBS的發(fā)病機制及治療策略[5-6]。本研究選用6周齡C57BL/6小鼠制作EAN模型，能夠代表經(jīng)典的GBS和其他炎性周圍神經(jīng)病的動物模型。

瞿麥為石竹科植物瞿麥的帶花全草，味苦性寒，歸心、膀胱、小腸經(jīng)，具有清熱利尿、破血通經(jīng)的效果，臨床療效廣泛?，F(xiàn)代藥理學研究表明，瞿麥具有抗瘤作用、利尿、興奮子宮、抗菌、抗氧化等多種藥理作用。另外，目前研究表明瞿麥還具有調(diào)控免疫細胞分化的作用，但其藥效物質(zhì)基礎尚不清楚。傅旭陽等[7]從瞿麥全草石油醚萃取物中分離得到9個化合物，分別鑒定為5-羥基-7，3′，4′-三甲氧基二氫黃酮、5，3′-二羥基 -7，4′- 二甲氧基二氫黃酮、5，4′-二羥基-7，3′-二甲氧基二氫黃酮、β-菠甾醇、胖大海A、(24R)-環(huán)阿屯-25-烯-3β，24-二醇、(24S)-環(huán)阿屯-25-烯-3β，24-二醇、豆甾-7-烯-3β-醇和羥基二氫博伏內(nèi)酯。臨床真正發(fā)揮藥理作用的主要成分為黃酮、蒽醌、皂苷等化合物[8]。

研究表明，某種致病因子打破機體免疫穩(wěn)態(tài)，導致自身反應性CD4+Th細胞的產(chǎn)生是GBS發(fā)病的基礎[9]。根據(jù)其免疫學特征的不同，CD4+T細胞可分為Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞和Treg細胞4個亞群[10]。在發(fā)病初期，GBS患者外周血Th1細胞和Th17細胞及其各自分泌的IFN-γ和IL-17水平均顯著增加；在疾病恢復期，Th1細胞和Th17細胞水平及其分泌的細胞因子IFN-γ、IL-17水平均顯著下降；同時Th2細胞和Treg在GBS發(fā)病過程中的演變與Th1、Th17細胞相反[11]。在GBS的動物模型EAN小鼠中，抑制Th1和Th17細胞的分化或增加Th2細胞和Treg水平均可改善EAN模型的臨床癥狀。因此，Th1細胞和Th17細胞為GBS發(fā)病中的致病性細胞，而Th2細胞、Treg被認為在GBS發(fā)病中發(fā)揮保護性作用，尤其是Treg，它是介導宿主免疫耐受的關鍵因素，Treg的數(shù)量減少或功能抑制被認為與GBS的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本研究結(jié)果顯示，瞿麥治療組在免疫后第28天，EAN小鼠臨床癥狀明顯改善，外周血Th1細胞和Th17細胞的數(shù)量均較發(fā)病時明顯降低，而Th2細胞和Treg明顯增加；酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測外周血TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平明顯減少。這與Reid-Adam等[3]研究發(fā)現(xiàn)的瞿麥可顯著抑制健康人群外周血幼稚性和記憶性自身免疫性T細胞增殖和分泌IFN-γ的能力，并促進調(diào)節(jié)性T細胞Treg細胞的增殖相一致。本研究結(jié)果并未顯示瞿麥組和對照組Th1細胞、Th2細胞水平存在統(tǒng)計學差異，這可能與樣本量少有關。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，瞿麥可顯著改善EAN小鼠模型的臨床癥狀，并可調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能，有望成為一種價廉物美治療GBS/EAN的藥物。由于本研究所用瞿麥為特殊提取物，其具體作用的有效成分并不明確，有必要在今后的工作中進一步探討。