孔賀磊，吳金恩，鄭亞?wèn)|，何貴天，李雅婷，丁軍濤*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046)

MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為19個(gè)～23個(gè)核苷酸、參與調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子[1]，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和病毒中。miRNA能通過(guò)與mRNA 3′UTR以完全或不完全配對(duì)的方式降解或抑制靶基因的表達(dá)，具有調(diào)控生物體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤形成及病毒感染等多種生物學(xué)功能[2]。已有研究報(bào)道，哺乳動(dòng)物有50%以上的蛋白表達(dá)基因受miRNA調(diào)控[3]。病毒作為一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生病原體，它的感染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)RNA的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生改變，特別是細(xì)胞內(nèi)miRNA。目前已有研究證實(shí)，哺乳動(dòng)物痘病毒和痘苗病毒能通過(guò)自身編碼的Poly A聚合酶VP55降解宿主細(xì)胞中的miRNA[4]，從而為痘病毒的感染創(chuàng)造條件。由此可見(jiàn)，痘病毒的感染過(guò)程與miRNA之間存在一定的相應(yīng)關(guān)系。

作為miRNA的一員，miR-10b不僅在哺乳動(dòng)物中廣泛分布，而且具有高度保守性，這暗示著miR-10b在生物體中可能扮演著重要角色。已有大量研究表明，miR-10b在腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)，如在肝癌[5]、食管癌[6]、胰腺癌[7]和鼻咽癌[8]等腫瘤組織中都有異常表達(dá)，這種異常與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]，且不影響細(xì)胞的活力和增殖能力。但是有關(guān)miR-10b在病毒感染方面的研究報(bào)道很少。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)Cytoscape生物信息軟件中的bioNGO插件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)oar-miR-10b分別與PAPOLA、HOXA1、INHBB、GATAD2A及BCL2L2等基因相互作用。已有研究證實(shí)[10-11]，PAPOLA、HOXA1、INHBB、GATAD2A等基因主要參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，而B(niǎo)CL2L2基因參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。當(dāng)BCL2L2的表達(dá)量升高時(shí)，細(xì)胞的凋亡就會(huì)受到抑制，這可能進(jìn)而為病毒的存活、繁殖和潛伏感染提供條件。

本研究以綿羊痘病毒(Sheop poxvirus,SPPV)感染綿羊睪丸細(xì)胞4 h后外泌體中miRNA的高通量測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)綿羊痘病毒感染綿羊睪丸細(xì)胞0、4、24、48、72 h外泌體中oar-miR-10b的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化情況，驗(yàn)證基因BCL2L2與oar-miR-10b的相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步研究oar-miR-10b在綿羊痘病毒感染過(guò)程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

綿羊睪丸細(xì)胞、293FT細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京全式金生物有限公司；限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XhoⅠ、DNA Marker、T4 DNA連接酶、克隆載體pMD18-T、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；cel-miR-39、引物、BCL2L2-MUT和oar-miR-10b的合成及測(cè)序均由上海生物科技有限公司完成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Trizol LS 試劑及脂質(zhì)體 R2000 Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告載體PmirGLO、DualGGlo RLuciferase Assay System檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)于天根科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中查取miR-10b序列，并選取Cel-miR-39作為外參基因，用DNAMAN和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成(表1)。

表1 oar-mir-10b和Cel-miR-39基因擴(kuò)增引物

1.2.2 Oar-miR-10b和Cel-miR-39的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)液總外泌體提取試劑(invitrogen)分別分離感染綿羊痘病毒0 h、4 h、24 h、48 h和72 h后的綿羊睪丸細(xì)胞的外泌體，同時(shí)，不同時(shí)期的外泌體中分別加入人工合成的Cel-miR-39基因作為外參基因。應(yīng)用Trizol LS分別提取5個(gè)不同時(shí)期外泌體中的總RNA，并以其為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈(圖1)，將合成的cDNA按照10倍梯度稀釋后，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，將反應(yīng)溶液充分混勻后，按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

圖1 miRNA檢測(cè)原理

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建 轉(zhuǎn)化、提取PmirGLO空載體并進(jìn)行雙酶切，將雙酶切的目的片段BCL2L2和PmirGLO 16℃過(guò)夜連接，將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)18 h后提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293FT細(xì)胞，以5×104CPU接種于96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)后，棄掉培養(yǎng)液后每孔加入100 μL的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基，置于室溫平衡15 min以上。每孔加入100 μL的Dual-Glo?Luciferase Reagent，室溫下避光放置15 min以上，用GloMax96熒光檢測(cè)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。加入100 μL的Dual-Glo?Stop&Glo?Reagent后至少等待15 min后再檢測(cè)海腎熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性檢測(cè)方法同螢火蟲(chóng)熒光素酶活性檢測(cè)方法相同，加入100 μL的Dual-Glo?Luciferase Reagent，室溫避光放置15 min后，用GloMax96熒光檢測(cè)儀檢測(cè)海腎熒光素酶活性并記錄數(shù)值。

分組如下。A組：PmirGLO空載體+Oar-mir-10b類(lèi)似物；B組：PmirGLO空載體+陰性對(duì)照(NC)；C組：PmirGLO BCL2L2-WT+Oar-mir-10b類(lèi)似物；D組：PmirGLO BCL2L2-WT+陰性對(duì)照(NC)；E組：PmirGLO BCL2L2-MUT+Oar-mir-10b類(lèi)似物；F組：PmirGLO BCL2L2-MUT+陰性對(duì)照(NC)。

轉(zhuǎn)染體系的配制：以A組為例，取無(wú)RNA酶1.5 mL EP管3個(gè)，分別標(biāo)記為A1、A2和A3，在A1管中加入98 μL DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基和1 μL PmirGLO空載體(0.45 μg/mL)，A2中加入98.2 μL DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基1.8 μL脂質(zhì)體2000，A3中加入95 μL無(wú)血清培養(yǎng)基10 μL Oar-mir-10b類(lèi)似物，各管混勻后冰上靜置5 min。分別在A2管中取50 μL混合液加入A1和A3，混勻后室溫靜置5 min。將A1和A3混勻，室溫靜置10 min。同理配制其他組溶液。在無(wú)菌條件下，將各組混合液吸取100 μL分別加入96孔板對(duì)應(yīng)組內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進(jìn)行熒光檢測(cè)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Prism 5對(duì)各組的雙熒光素酶活性比值進(jìn)行分析，并用One-way ANOVA進(jìn)行組內(nèi)的差異性分析，而組間則用Student′s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。*代表P<0.05，**代表P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 外參cel-miR-39基因檢測(cè)及oar-miR-10b在病毒感染不同時(shí)段的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析

從cel-miR-39的溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線以及miR-10b的溶解曲線可知，兩種引物都具有較高的特異性。分別在綿羊痘病毒感染綿羊睪丸細(xì)胞后0 h、4 h、24 h、48 h和72h對(duì)外泌體中的oar-miR-10b進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，在綿羊痘病毒感染的不同時(shí)期，外泌體中的oar-miR-10b呈現(xiàn)不同的差異表達(dá)，主要為先增加后減少的趨勢(shì)，在感染后24 h的差異表達(dá)量最大，達(dá)到2.15倍(圖2)，隨后逐步降低。感染4 h后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果分析表明，miR-10b的變化情況基本一致。

2.2 BCL2L2 RT-PCR擴(kuò)增

對(duì)提取的細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后，將所得產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示目的條帶大小在220 bp左右，與預(yù)期目的條帶大小一致(圖3)。

2.3 pMD-18-T-BCL2L2-WT、PmirGLO-BCL2L2-WT、PmirGLO-BCL2L2-MUT重組質(zhì)粒的鑒定

根據(jù)DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)將目的片段回收純化后，與pMD-18-T載體進(jìn)行過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中并挑取單克隆菌株進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。菌液PCR檢測(cè)獲得目的條帶后小提質(zhì)粒并進(jìn)行SacⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切獲得的目的條帶與預(yù)期大小一致，分別為2700 bp和220 bp左右(圖4A)，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期堿基序列完全一致。將提取的pMD-18-T-BCL2L2-WT陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，用DNA回收試劑盒回收220 bp左右的目的條帶并與PmirGLO載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至DH5α后進(jìn)行抗性篩選，挑取單克隆菌株并進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。用DNA小提質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行SacⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切條帶大小與預(yù)期一致，分別為7360 bp和220 bp左右(圖4B)。將人工合成的BCL2L2-MUT與PmirGLO空載體進(jìn)行SacⅠ、XhoⅠ雙酶切，產(chǎn)物回收后用T4連接酶過(guò)夜連接、轉(zhuǎn)化和搖菌培養(yǎng)。提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，檢測(cè)結(jié)果顯示目的條帶與預(yù)期大小一致，分別為7 360 bp和230 bp左右(圖4C)。

A.cel-miR-39的實(shí)時(shí)定量；B.cel-miR-39的原始熒光值；C.cel-miR-39的溶解曲線；D.cel-miR-39的RT-qRCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；E.Oar-miR-10b的實(shí)時(shí)定量；F.oar-miR-10b的原始熒光值；G.oar-miR-10b 的溶解曲線；H.oar-miR-10b在不同感染時(shí)期的表達(dá)量

A.Real-time quantification of cel-miR-39; B.The original fluorescence value of cel-miR-39; C.Dissolution curve of cel-miR-39; D.RT-qRCR standard curve for cel-miR-39; E.Real-time quantification of oar-miR-10b; F.The original fluorescence value of oar-miR-10b; G.Dissolution curve of oar-miR-10b; H.Oar-miR-10b expression at different stages of infection

圖2 Oar-miR-10b實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

Fig.2 Real-time qPCR amplification of oar-miR-10b

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.BCL2L2基因片段M.DNA Marker DL 2 000; 1.BCL2L2 gene fragment

2.4 Dual-PmirGLO報(bào)告載體基因熒光強(qiáng)度檢測(cè)

分別將構(gòu)建好的PmirGLO-BCL2L2-MUT和PmirGLO-BCL2L2-WT重組質(zhì)粒與Oar-miR-10b mimic和miRNA Negative control根據(jù)分組共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞中，其作用位點(diǎn)見(jiàn)圖5，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行Dual-PmirGLO報(bào)告載體基因熒光檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，PmirGLO-BCL2L2-WT和oar-miR-10b mimic共轉(zhuǎn)染組與PmirGLO-BCL2L2-WT+miRNA Negative Control共轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，其檢測(cè)到的相對(duì)熒光強(qiáng)度值下降至對(duì)照組的0.58倍(圖6)，而PmirGLO-BCL2L2-MUT和 oar-miR-10b mimic共轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，表明oar-miR-10b可以顯著抑制BCL2L2基因的表達(dá)，同時(shí)也說(shuō)明BCL2L2是oar-miR-10b的靶基因，其轉(zhuǎn)錄后的翻譯受oar-miR-10b的調(diào)控。

A.pMD-18-T-BCL2L2-WT重組載體雙酶切鑒定的凝膠電泳圖;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.pMD-18-T-BCL2L2-WT雙酶切;B.PmirGLO-PmirGLO-BCL2L2-WT雙酶切鑒定的凝膠電泳圖;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.PmirGLO-BCL2L2-WT雙酶切;C.PmirGLO-BCL2L2-MUT雙酶切鑒定的凝膠電泳圖;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.PmirGLO-BCL2L2-MUT雙酶切

A.Agarose gel electrophoresis analysis of restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pMD-18-T-BCL2L2-WT bySacⅠ andXhoⅠ; M.DNA Marker DL 5 000; 1.Double enzyme digestion of pMD-18-T-BCL2L2-WT;B.Agarose gel electrophoresis analysis of restriction enzyme digestion of recombinant plasmid PmirGLO-PmirGLO-BCL2L2-WT bySacⅠ andXhoⅠ; M.DNA Marker DL 15 000; 1.Double enzyme digestion of PmirGLO-BCL2L2-WT;C.Agarose gel electrophoresis analysis of restriction enzyme digestion of recombinant plasmid PmirGLO-BCL2L2-MUT bySacⅠ andXhoⅠ;M.DNA Marker DL 15 000; 1.Double enzyme digestion of PmirGLO-BCL2L2-MUT

圖4重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Fig.4 Identification of recombinant plasmids by double enzyme digestion

圖5 oar-miR-10b靶向BCL2L2的作用關(guān)系

3 討論

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為19 nt～23 nt的保守核苷酸序列，其可通過(guò)結(jié)合到靶基因的mRNA上，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，對(duì)增殖、分化、凋亡等基本細(xì)胞過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。miR-10b作為miRNAs家族中的一員，目前對(duì)其的研究多集中于同腫瘤之間的關(guān)系。如已有研究證實(shí)，在食管癌[6]、胰腺癌[7]和鼻咽癌[8]等腫瘤組織中都有異常表達(dá)，主要為miR-10b的上調(diào)，并且這種異常與腫瘤的侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。另有研究表明，抑制miR-10b，降低了T-bet mRNA、RORyt mRNA表達(dá)水平，同時(shí)也降低了IFN-γ和IL-17表達(dá)水平，這說(shuō)明了抑制miR-10b表達(dá)減弱了TH1和TH17細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。由此可見(jiàn)，miR-10b的上調(diào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞癌變，甚至增強(qiáng)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，而下調(diào)則會(huì)引起宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

“WT ”為野生株；“MUT”為突變株

“WT ”wild strain；“MUT”mutant strain

圖6 Oar-miR-10b直接靶向重組載體
PmirGLO-BCL2L2的3′UTR

Fig.6 Direct targeting of BCL2L2 3′UTR by oar-miR-10b
with recombination of PmirGLO vector

探究miRNA的作用機(jī)制，關(guān)鍵是認(rèn)識(shí)miRNA與其靶基因的相互作用關(guān)系。本研究中，通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)并結(jié)合靶基因功能分析，篩選出與細(xì)胞凋亡過(guò)程密切相關(guān)的BCL2L2作為miR-10b的候選靶基因。BCL2L2也稱(chēng)為Bcl-w，是BCL-2蛋白家族的成員，該家族蛋白為一類(lèi)凋亡過(guò)程中重要的調(diào)控因子，包含抗凋亡蛋白(BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、CED9等)和促凋亡蛋白(Bax、Bak、BCL-XS、Bad、Bik、Bid等)[13]。大量研究證實(shí)，BCL2L2為原癌基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的功能，BCL2L2由于與促凋亡成員相互拮抗作用以及它們之間作用的不平衡競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響，當(dāng)BCL2L2在二聚體中占據(jù)優(yōu)勢(shì)時(shí)可以抑制細(xì)胞凋亡起到促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[14]。

病毒感染宿主細(xì)胞后往往會(huì)導(dǎo)致兩種結(jié)果：一是通過(guò)直接誘導(dǎo)宿主細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制以限制病毒生長(zhǎng)；二是由于病毒蛋白或病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白抑制細(xì)胞凋亡，從而為病毒的繁殖、潛伏感染和后續(xù)的持續(xù)感染創(chuàng)造條件[15]。有研究已報(bào)道，PEDV[10]、EBV[16]和HCMV等病毒感染宿主細(xì)胞后會(huì)上調(diào)BCL2家族基因，進(jìn)而阻斷P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制[17]。本研究用雙熒光素酶報(bào)告載體鑒定BCL2L2與oar-miR-10b的關(guān)系，研究結(jié)果表明，PmirGLO-BCL2L2-WT+oar-miR-10b mimic共轉(zhuǎn)染組與PmirGLO-BCL2L2-WT+miRNA Negative Control共轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比差異極顯著，初步鑒定出BCL2L2為oar-miR-10b的靶基因，試驗(yàn)結(jié)果提示上調(diào)的BCL2L2基因可能在綿羊痘病毒感染過(guò)程中起著重要作用，這為羊痘病毒感染后的繁殖、調(diào)控等機(jī)理研究提供了理論基礎(chǔ)。