李 琦，孫翠翠,2，朱子鳳，劉 群*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.南通大學(xué)實驗動物中心，江蘇南通 226000；3.西南民族大學(xué)校醫(yī)院，四川成都 610041)

綠蘿花(ScindapsusaureusLinden ex Andre，Engl)為天南星科(Araceae)喜林芋屬植物綠蘿花的干燥花蕾(別名石柑子、馬蹄金、黃金葛等)，產(chǎn)于西藏和喜馬拉雅山脈寒冷地帶。藏區(qū)習(xí)俗泡茶飲用于預(yù)防和治療高血壓、高血脂、糖尿病及各類血管炎癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，綠蘿花具有降血糖[1-4]、降血脂[5-6]、抗氧化[7-9]和增強機體免疫功能的作用。本研究在楊榮等[10]和孫翠翠等[11]的體外抗腫瘤和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究成果基礎(chǔ)之上，以水萃取和醇沉法制備綠蘿花浸膏和粗多糖為研究材料，流式細(xì)胞術(shù)為檢測手段，S180荷瘤小鼠CTL、HTL、NK細(xì)胞為檢測指標(biāo)，探討綠蘿花對機體腫瘤免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 S180肉瘤小鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。清潔級KMRI小鼠，雄性，6周齡，體重18 g～22 g，購自四川省達(dá)碩有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川2015-030)。

1.1.2 研究材料 綠蘿花干燥花蕾，購自四川宇妥藏藥藥業(yè)有限責(zé)任公司，由西南大學(xué)園藝園林學(xué)院鑒定(鑒定人：李先源)。綠蘿花浸膏和粗多糖的提取參考文獻(xiàn)[12]和[13]進行，由本研究室制備、保存。

1.1.3 試劑及儀器 FITC標(biāo)記的抗鼠單克隆抗體CD3、APC標(biāo)記的抗鼠單克隆抗體CD4、APC-CY7標(biāo)記的抗鼠單克隆抗體CD8、PE標(biāo)記的抗鼠單克隆抗體CD335、FITc標(biāo)記的小鼠IgGI(553971)美國BD公司產(chǎn)品；APC標(biāo)記的小鼠IgGI、APC-CY7標(biāo)記的小鼠IgGI、PE標(biāo)記的小鼠IgGI、流式上樣管，美國BD公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 綠蘿花浸膏和粗多糖口服液的制備 綠蘿花浸膏口服液：將浸膏換算成生藥含量并配制成50%、100%、200%濃度的口服液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。綠蘿花粗多糖口服液：將粗多糖換算成生藥含量并配制成100 mg/mL濃度的口服液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 荷瘤S180小鼠建立 取S180肉瘤生長良好小鼠，取瘤體制備瘤細(xì)胞懸液。取10 μL瘤細(xì)胞懸液稀釋10倍后加入等體積的4 g/L臺酚藍(lán)染色進行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整瘤細(xì)胞濃度為1×106個/mL。無菌接種于小鼠右前肢腋部皮下(0.2 mL/只)。

1.2.3 實驗動物分組及處理 小鼠接種S180瘤細(xì)胞24 h后，隨機分為6組，每組21只，另設(shè)空白對照組。各組處理如下(注：除健康對照組外，其余各組的腫瘤大于1 g，為荷瘤小鼠)：健康對照組：每天灌胃生理鹽水0.2 mL，連續(xù)28 d；模型對照組：每天灌胃生理鹽水0.2 mL，連續(xù)28 d；高劑量組：每天灌胃綠蘿花口服液(2.0 g/kg)，連續(xù)28d；中劑量組：每天灌胃綠蘿花口服液(1.0 g/kg)，連續(xù)28 d；低劑量組：每天灌胃綠蘿花口服液(0.5 g/kg)，連續(xù)28 d；多糖組：每天灌胃綠蘿花多糖口服液(100 mg/kg)，連續(xù)28 d；陽性對照組：每天灌胃環(huán)磷酰胺(20 mg/kg)，連續(xù)28 d。

接種24 h后開始灌服藥物，每日1次。在給藥的第7、14、28天，每組隨機抽取7只小鼠，摘眼球采血，用于檢測CTL、HTL、NK細(xì)胞活性。

1.2.4 腫瘤免疫相關(guān)活性細(xì)胞檢測 具體操作流程(淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記-溶血-洗滌-重懸-檢測)按照測試試劑盒說明書進行。同型對照管作為定標(biāo)，檢測10 000個細(xì)胞；以前向散射角(FSC)為橫坐標(biāo)，側(cè)向散射角(SSC)為縱坐標(biāo)的二維散點圖上，按照外周血中血細(xì)胞大小和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度，分為細(xì)胞碎片、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；應(yīng)用flowjo 10.1軟件計算淋巴細(xì)胞中各標(biāo)記細(xì)胞的百分率。

2 結(jié)果

2.1 綠蘿花對CD3+T細(xì)胞的影響

不同劑量綠蘿花浸膏口服液、綠蘿花多糖口服液在不同檢測點對S180荷瘤小鼠CD3+T細(xì)胞影響見表1和表2。健康小鼠血液中的CD3+T細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定，接種S180瘤細(xì)胞7 d后，荷瘤對照組小鼠CD3+T細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)極顯著降低(P<0.01)，且隨著時間的延長(14 d和28 d)呈極顯著下降(P<0.01)；口服低濃度綠蘿花口服液7 d后，荷瘤小鼠CD3+T細(xì)胞數(shù)量低于健康小鼠(P<0.05)，隨著給藥時間的延長(14 d和28 d)也呈極顯著下降(P<0.01)，但在給藥28 d時，CD3+T細(xì)胞數(shù)量極顯著高于荷瘤對照組小鼠(P<0.01)；口服中濃度綠蘿花口服液7 d后，荷瘤小鼠CD3+T細(xì)胞數(shù)量與健康小鼠相當(dāng)(P>0.05)，且隨著給藥時間的延長(14 d和28 d)也呈極顯著和顯著升高(P<0.01，P<0.05)并極顯著高于低濃度綠蘿花組(P<0.01)；口服高濃度綠蘿花口服液7 d后，荷瘤小鼠CD3+T細(xì)胞數(shù)量與健康小鼠相當(dāng)(P>0.05)，且隨著給藥時間的延長(14 d和28 d)呈極顯著升高(P<0.01)并與中濃度綠蘿花組相當(dāng)(P>0.05)；口服綠蘿花多糖口服液7 d后，荷瘤小鼠CD3+T細(xì)胞數(shù)量顯著高于健康小鼠(P<0.05)，極顯著高于荷瘤對照組小鼠(P<0.01)，隨著給藥時間的延長(14 d和28 d)也呈極顯著升高(P<0.01)并極顯著高于3個濃度的綠蘿花浸膏口服液組(P<0.01)；口服環(huán)磷酰胺7 d后，荷瘤小鼠CD3+T細(xì)胞數(shù)量均極顯著高于其他各組(P<0.01)，但隨著給藥時間的延長(14 d和28 d)呈極顯著下降趨勢(P<0.01)，雖與高濃度綠蘿花組相當(dāng)(P>0.05)，但極顯著低于綠蘿花多糖組(P<0.01)。結(jié)果表明，小鼠接種S180瘤細(xì)胞后，血液中CD3+T細(xì)胞數(shù)量下降，口服不同劑量綠蘿花口服液、綠蘿花多糖和環(huán)磷酰胺后，在不同檢測時間點，荷瘤小鼠血液中CD3+T細(xì)胞數(shù)量升高，中、高劑量綠蘿花、綠蘿花多糖、環(huán)磷酰胺作用明顯，尤其以多糖升高效果最佳，且隨著給藥時間的延長，效果越明顯，說明綠蘿花(1 g/kg～2.0 g/kg)及綠蘿花多糖(100 mg/kg)連續(xù)口服7 d～28 d，具有升高由S180瘤細(xì)胞引起的小鼠血液中CD3+T細(xì)胞數(shù)量下降趨勢的作用。

2.2 綠蘿花對CD4+/CD8+比值的影響

不同劑量綠蘿花浸膏口服液、綠蘿花多糖口服液在不同檢測點對S180荷瘤小鼠CD4+/CD8+T細(xì)胞比值影響見表3和表4。

表1 各組CD3+T細(xì)胞數(shù)量組間比較(%,±SD，n=7)

注:同行數(shù)據(jù)肩上標(biāo)有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:The data marked with the same lowercase letters in the same row indicate no significant difference (P>0.05)，with different small letters mean significant difference (P<0.05) and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

表2 各組CD3+T細(xì)胞數(shù)量組內(nèi)比較(%,±SD，n=7)

注:同列數(shù)據(jù)肩上標(biāo)有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:The data marked with the same lowercase letters in the same column indicate no significant difference (P>0.05)，with different small letters mean significant difference (P<0.05) and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

表3 各組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值組間比較±SD，n=7)

注:同行數(shù)據(jù)肩上標(biāo)有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:The data marked with the same lowercase letters in the same row indicate no significant difference (P>0.05)，with different small letters mean significant difference (P<0.05) and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

表4 各組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值組內(nèi)比較±SD，n=7)

注:同列數(shù)據(jù)肩上標(biāo)有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:The data marked with the same lowercase letters in the same column indicate no significant difference (P>0.05)，with different small letters mean significant difference (P<0.05) and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

表3和表4表明，荷瘤對照組，低、中劑量綠蘿花組荷瘤小鼠血液HTL/CTL細(xì)胞比值(CD4+/CD8+T細(xì)胞)，在接種S180瘤細(xì)胞7 d～28 d與健康小鼠比較差異不顯著(P>0.05)；口服高濃度綠蘿花口服液7 d后，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值升高后呈下降趨勢(P<0.05)并與其他各組差異不顯著(P>0.05)；口服綠蘿花多糖口服液及環(huán)磷酰胺7 d～28 d后，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值在各檢測時間的組間組內(nèi)比較差異不顯著(P>0.05)。試驗結(jié)果表明，在接種S180瘤細(xì)胞后，小鼠血液中的CD4+/CD8+T細(xì)胞比值無變化，同樣各給藥組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值差異不顯著，說明接種S180瘤細(xì)胞及綠蘿花(0.5 g/kg～2.0 g/kg)及綠蘿花多糖(100 mg/kg)連續(xù)口服28 d，對 S180荷瘤小鼠和健康小鼠血液中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值無影響。

2.3 綠蘿花對CD335+細(xì)胞的影響

不同劑量綠蘿花浸膏口服液、綠蘿花多糖口服液在不同檢測點對S180荷瘤小鼠CD335+T淋巴細(xì)胞影響見表5和表6。

表5 各組CD335+T細(xì)胞數(shù)量組間比較(%,±SD，n=7)

注:同行數(shù)據(jù)肩上標(biāo)有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:The data marked with the same lowercase letters in the same row indicate no significant difference (P>0.05)，with different small letters mean significant difference (P<0.05) and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

表6 各組CD335+T細(xì)胞數(shù)量組內(nèi)比較(%,±SD，n=4)

注:同列數(shù)據(jù)肩上標(biāo)有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:The data marked with the same lowercase letters in the same column indicate no significant difference (P>0.05)，with different small letters mean significant difference (P<0.05) and with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).

表5和表6表明，健康小鼠血液中的CD335+T細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定，接種S180瘤細(xì)胞7 d后，荷瘤對照組小鼠CD335+T細(xì)胞數(shù)量下降，雖無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但隨著時間的延長(14 d和28 d)呈下降趨勢；口服低濃度綠蘿花口服液7 d后，荷瘤小鼠CD335+T細(xì)胞數(shù)量雖與健康小鼠、荷瘤對照組小鼠相當(dāng)(P>0.05)，但隨著給藥時間的延長(14 d和28 d)呈上升趨勢，在給藥28 d時，CD335+T細(xì)胞數(shù)量顯著高于荷瘤對照組小鼠(P<0.05)；口服中濃度綠蘿花口服液7 d后，荷瘤小鼠CD335+T細(xì)胞數(shù)量雖與健康小鼠、荷瘤對照組小鼠相當(dāng)(P>0.05)，但隨著給藥時間的延長(14 d和28 d)呈上升趨勢，在給藥28 d時，CD335+T細(xì)胞數(shù)量達(dá)到顯著升高(P<0.05)并極顯著高于健康小鼠和荷瘤對照組小鼠(P<0.01)；口服高濃度綠蘿花口服液7 d后，荷瘤小鼠CD335+T細(xì)胞數(shù)量雖與健康小鼠、荷瘤對照組小鼠相當(dāng)(P>0.05)，隨著給藥時間的延長(14 d和28 d)呈下降和上升趨勢，但差異不顯著(與低、中綠蘿花組也無統(tǒng)計學(xué)意義)；口服綠蘿花多糖口服液7 d后，荷瘤小鼠CD335+T細(xì)胞數(shù)量雖與健康小鼠、荷瘤對照組小鼠相當(dāng)(P>0.05)，但隨著給藥時間的延長(14 d、28 d)CD335+T細(xì)胞數(shù)量呈上升趨勢，28 d時達(dá)到極顯著差異(P<0.01)且極顯著高于其他各組(P<0.01)；口服環(huán)磷酰胺7 d后，荷瘤小鼠CD335+T細(xì)胞數(shù)量雖與健康小鼠、荷瘤對照組小鼠相當(dāng)(P>0.05)，隨著給藥時間的延長，CD335+T細(xì)胞數(shù)量變化不大，但在給藥的28 d，顯著低于綠蘿花多糖組(P<0.05)。試驗結(jié)果表明，接種S180瘤細(xì)胞后，小鼠血液中CD335+T細(xì)胞數(shù)量雖有下降，但差異并不顯著；口服環(huán)磷酰胺后，荷瘤小鼠血液中CD335+T細(xì)胞數(shù)量變化不大；口服不同劑量綠蘿花及綠蘿花多糖均能提高荷瘤小鼠血液中CD335+T細(xì)胞數(shù)量，以中濃度綠蘿花和綠蘿花多糖效果最佳，且隨著給藥時間延長，效果越明顯，說明綠蘿花(1.0 g/kg)及綠蘿花多糖(100 mg/kg)連續(xù)口服14～28 d，具有升高S180瘤荷小鼠和健康小鼠CD335+T細(xì)胞數(shù)量的作用。

3 討論

3.1 腫瘤免疫相關(guān)活性細(xì)胞

淋巴細(xì)胞在機體的免疫應(yīng)答中起著重要的作用，特別是在天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)換中起著重要的橋梁作用。在天然免疫系統(tǒng)中重要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞主要有T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞亞群主管細(xì)胞免疫，具有抵抗病毒和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用，其細(xì)胞功能取決于T淋巴細(xì)胞總值(CD3+)及其亞群細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CD8+)和輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+)的相對組成，CD3+T細(xì)胞數(shù)量的變化可反應(yīng)機體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)；CD4+T細(xì)胞是調(diào)控免疫反應(yīng)重要樞紐細(xì)胞，起誘導(dǎo)和輔助作用；CD8+T細(xì)胞是免疫反應(yīng)中直接殺傷性細(xì)胞，起抑制和毒殺作用；CD4+/CD8+T細(xì)胞比值(免疫平衡水平)是判斷機體免疫功能紊亂的敏感指標(biāo)，生理情況下，亞群間互相拮抗達(dá)到平衡，比值維持在一定范圍，當(dāng)免疫失衡，比值發(fā)生異常[14]。自然殺傷細(xì)胞具有部分T細(xì)胞分化抗原和IL-2受體，在IL-2刺激下可誘發(fā)產(chǎn)生IFN-γ并與靶細(xì)胞接觸釋放穿孔素，導(dǎo)致細(xì)胞溶解并分泌顆粒酶，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，是天然免疫系統(tǒng)中重要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞[15]。測定腫瘤動物T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量及活性是評價藥物的抗腫瘤作用重要指標(biāo)。

3.2 藏藥綠蘿花及多糖對腫瘤免疫功能的影響

T淋巴細(xì)胞表面分布著CD3+，CD3+連接T淋巴細(xì)胞與抗原受體信號的傳遞，故可將CD3+數(shù)目用來衡量T淋巴細(xì)胞數(shù)目[16]。腫瘤會導(dǎo)致外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)下降、CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值降低及小鼠CD3+、NK細(xì)胞數(shù)降低，機體免疫功能下降[17]。本研究表明，小鼠接種S180瘤細(xì)胞后，血液中CD3+T細(xì)胞數(shù)量下降，CD335+T細(xì)胞下降變化不明顯，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值變化無統(tǒng)計學(xué)意義；不同劑量綠蘿花及綠蘿花多糖能有效抑制T淋巴細(xì)胞增殖能力的下降，表現(xiàn)為CD3+、CD335+T細(xì)胞數(shù)量上升，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值相對穩(wěn)定，從而達(dá)到提高機體的腫瘤免疫功能，尤其是綠蘿花(1 g/kg～2.0 g/kg)及綠蘿花多糖(100 mg/kg)連續(xù)口服7 d～28 d升高CD3+T細(xì)胞效果明顯，且隨著給藥時間的延長，效果越佳；綠蘿花(1.0 g/kg)及綠蘿花多糖(100 mg/kg)連續(xù)口服14 d～28 d，升高S180瘤荷小鼠和健康小鼠CD335+T細(xì)胞數(shù)量效果明顯，且隨著給藥時間的延長，效果越佳；接種S180瘤細(xì)胞及綠蘿花(0.5 g/kg～2.0 g/kg)及綠蘿花多糖(100 mg/kg)連續(xù)口服28 d，對 S180荷瘤小鼠和健康小鼠血液中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值無影響。由于腫瘤發(fā)病率的日益增加，人類對健康的渴望越來越急切，對副作用小的抗腫瘤藥物的研究備受矚目，鑒于綠蘿花富含多種生物活性成分及其良好的生物安全性，能夠較好的調(diào)節(jié)機體免疫力，更加突顯研究綠蘿花活性成分——多糖對機體抗腫瘤及其調(diào)節(jié)免疫功能作用的意義。