尹 君，李景丁莎，左從林，張惠銘，佘銳萍

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193； 2.北京昭衍新藥研究中心股份有限公司, 北京 100176)

肝細(xì)胞癌是最為常見的一種惡性腫瘤，我國(guó)每年約有38.3萬(wàn)人死于肝癌，約占全球肝癌死亡總數(shù)的51%[1]。2015年中國(guó)癌癥流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，我國(guó)肝癌的發(fā)病及病死率均居于第3位[2]。肝癌惡性程度較高、病情進(jìn)展快，大部分患者(> 80%)就診時(shí)已為晚期，不適合手術(shù)切除。即便可以手術(shù)切除的肝癌，2年復(fù)發(fā)率也高達(dá)50%。傳統(tǒng)化療后平均中位生存期僅為3～5個(gè)月[3]。肝癌治療藥物主要集中于傳統(tǒng)化療藥物—細(xì)胞毒性藥物的研究，以及通過(guò)研究肝癌發(fā)病機(jī)制開發(fā)其他類型的新藥，如基因藥物以及分子靶向藥物等[4]。因此，選擇成熟并有價(jià)值的動(dòng)物肝癌模型進(jìn)行研究，顯得極為重要。目前，可用于藥物研發(fā)用的肝癌動(dòng)物模型種類很多，其中肝內(nèi)移植腫瘤細(xì)胞的動(dòng)物模型是最接近人類原發(fā)肝癌的模型，由于其對(duì)技術(shù)要求較高，且需要用到免疫缺陷小鼠作為動(dòng)物載體，因此在治療肝癌藥物的研發(fā)中的應(yīng)用還不是十分廣泛[5]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用三種不同人源性肝癌細(xì)胞原位移植于不同程度免疫缺陷小鼠肝內(nèi)，通過(guò)對(duì)比分析肝腫瘤發(fā)生率、腫瘤大小以及動(dòng)物死亡情況，以建立較為成熟并有價(jià)值的肝癌細(xì)胞移植模型，為抗肝癌藥物的研發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c裸鼠30只[SCXK(京)2012-0001]，體重14～16 g，4～5周齡。SPF級(jí)NOD-SCID 小鼠30只[SCXK(京)2012-0001]，體重14～16 g，4～5周齡。SPF級(jí)NOG小鼠30只[SCXK(京)2011-0011]，體重14～16 g，4～5周齡。SPF級(jí)NPG小鼠30只[SCXK(京)2014-0001]，體重14～16 g，4～5周齡。均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物飼養(yǎng)及無(wú)菌手術(shù)于本中心SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK(京)2014-0006]中進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)IACUC編號(hào)為：ACU16-219。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中遵循3R原則。

1.1.2 人源肝癌細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞HepG2：購(gòu)自上海南方模式生物研究中心，培養(yǎng)條件為DMEM(高糖)+10% FBS，37℃、5% CO2培養(yǎng)；人肝癌細(xì)胞HUH-7：來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，培養(yǎng)條件為DMEM(高糖)+10% FBS，37℃、5% CO2培養(yǎng)；人肝癌細(xì)胞QGY-7703：購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)條件為1640+10% FBS，37℃、5% CO2培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

全封閉式組織脫水機(jī)(Asp300，LAICA，美國(guó))、組織包埋機(jī)(EG1150H，LAICA，美國(guó))、半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2235，LAICA，美國(guó))、攤片烤片一體機(jī)(CS-VI，LAICA，美國(guó))、全自動(dòng)染色封片一體機(jī)(CV5030，LAICA，美國(guó))，恒溫烤箱(DRP-9082，中國(guó))，生物顯微鏡(CX31，奧林巴斯，日本)，便攜式彩色多普勒超聲診斷儀(S8Exp，深圳開立生物醫(yī)療科技股份有限公司，中國(guó))。二甲苯、乙醇(北京化工廠，中國(guó))，蘇木素、伊紅(北京世濟(jì)合力生物科技有限公司，中國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

BALB/c裸鼠、NOD SCID 小鼠、NOG小鼠和NPG小鼠每個(gè)種屬30只動(dòng)物分成12組，每組10只，分別接種HepG2細(xì)胞、HUH-7和QGY-7703細(xì)胞。(表1)

1.3.2 實(shí)驗(yàn)操作

用基質(zhì)膠調(diào)整HepG2細(xì)胞至8.5×107/mL，HUH-7細(xì)胞調(diào)整至4.7×107/mL，QGY-7703細(xì)胞調(diào)整至1.25×108/mL，然后分別以每只0.06 mL原位接種于動(dòng)物肝。將待接種動(dòng)物戊巴比妥鈉麻醉后，腹部切口暴露肝左外葉，使用無(wú)菌注射器將細(xì)胞懸液接種于肝組織中，單點(diǎn)注射，干棉球壓迫止血后縫合肌肉和皮膚切口。

應(yīng)用小動(dòng)物B超成像儀對(duì)接種腫瘤動(dòng)物進(jìn)行觀察，確認(rèn)是否有腫瘤組織生長(zhǎng)。對(duì)實(shí)驗(yàn)期間死亡動(dòng)物以及計(jì)劃安樂(lè)死動(dòng)物(第92天和第104天)進(jìn)行大體解剖，對(duì)主要臟器進(jìn)行觀察。并取材各主要臟器(包含肝、心、脾、肺、腎、腦)，用于組織病理學(xué)檢查，以觀察肝腫瘤和其他臟器的腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。統(tǒng)計(jì)小鼠生存時(shí)間和臟器重量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物死亡情況

本實(shí)驗(yàn)中，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在手術(shù)過(guò)程中均出現(xiàn)死亡，由于死亡動(dòng)物數(shù)量較少(不超過(guò)30%)，因此認(rèn)為手術(shù)中動(dòng)物的死亡不影響本實(shí)驗(yàn)研究。(表2)

2.2 移植瘤模型的建立

應(yīng)用小動(dòng)物B超成像儀，在實(shí)驗(yàn)開始1個(gè)月以后，對(duì)接種腫瘤動(dòng)物進(jìn)行超聲檢查，確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織區(qū)域均可見密度增強(qiáng)區(qū)域(參見圖1a)。對(duì)死亡動(dòng)物及安樂(lè)死動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，發(fā)現(xiàn)小鼠肝均可見腫瘤結(jié)節(jié)，多呈結(jié)節(jié)狀突起，色澤蒼白，腫瘤組織與周圍肝組織界限較為清楚。切面呈灰白色，質(zhì)軟。結(jié)合B超成像結(jié)果(參見圖1b)以及大體解剖觀察，確認(rèn)成功造模，三種腫瘤細(xì)胞均可成功移植。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組Table 1 Grouping of the experimental animals

表2 手術(shù)實(shí)施過(guò)程中動(dòng)物死亡統(tǒng)計(jì)表Table 2 Animal death during operations

注：a：B超結(jié)果顯示小鼠肝處長(zhǎng)度為6.77～4.51 mm區(qū)域密度增強(qiáng)，確認(rèn)為腫瘤結(jié)節(jié)區(qū)域；b：NOG和NPG小鼠生存時(shí)間顯著低于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠。圖1 肝B超圖片和HepG2肝癌細(xì)胞懸液注射不同免疫缺陷小鼠生存曲線圖Note. a: B-mode ultrasonography showed that the density of the mouse liver at the region of 6.77 to 4.51 mm was is increased and confirmed as the tumor nodule region; b: Survival curves of the various immunodeficient mice injected with HepG2 hepatoma cell suspensions showed that the survival time of NOG and NPG mice was significantly shorter than that of BALB/c nude and NOD SCID mice.Figure 1 Mouse liver B-mode ultrasonography and survival curves of the various immunodeficient mice injected with HepG2 hepatoma cells

2.3 組織學(xué)檢查

各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物肝組織均可見大量的人源性肝癌細(xì)胞，并具有大量病理核分裂像，同時(shí)組織中心部位大面積壞死(參見圖2)。

2.4 HepG2組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組小鼠均于實(shí)驗(yàn)第20天左右發(fā)生死亡。其中NOG小鼠和NPG小鼠平均生存時(shí)間顯著低于BALB/c裸鼠以及NOD SCID小鼠。中位生存時(shí)間也顯著低于BALB/c裸鼠以及NOD SCID小鼠。

各實(shí)驗(yàn)組小鼠動(dòng)物肝均可見腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，因各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存時(shí)間不同，不再進(jìn)行臟器重量的統(tǒng)計(jì)。(表3～4)

2.5 HUH-7及QGY-7703組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組僅BALB/c裸鼠未發(fā)生意外死亡，且隨著動(dòng)物免疫缺陷程度越高，動(dòng)物死亡率也就相應(yīng)增加，因此動(dòng)物死亡與免疫缺陷程度呈一定的相關(guān)性。

HUH-7和QGY-7703肝癌細(xì)胞接種動(dòng)物后，NOG小鼠和NPG小鼠肝重量顯著大于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠，差異顯著(參見表5， 圖3)。說(shuō)明HUH-7和QGY-7703腫瘤細(xì)胞在NOG小鼠和NPG小鼠肝中生長(zhǎng)更加迅速。

3 討論

原位移植瘤模型是近年發(fā)展的新熱點(diǎn)，可以模擬肝癌的發(fā)生、發(fā)展及結(jié)局，是最接近人類原發(fā)肝癌的動(dòng)物模型[6]。朱瑞東等[7]將人HepG2細(xì)胞移植于小鼠皮下并成瘤，然后用此移植瘤組織再接種于小鼠肝內(nèi)，建模成功率為90%；韓客起等[8]使用肝癌細(xì)胞株H22建立異位移植模型，肝原位移植瘤成模率達(dá)到95.6%。除原位接種腫瘤細(xì)胞以外，Soares等[9]從脾門靜脈中注射腫瘤細(xì)胞，從而建立小鼠肝腫瘤原位移植模型，White等[10]經(jīng)超聲引導(dǎo)下，經(jīng)皮植入腫瘤細(xì)胞從而建立兔肝腫瘤模型。綜合上述文獻(xiàn)報(bào)道已知，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多學(xué)者致力于肝癌動(dòng)物模型的研究，但是基本還是以正常動(dòng)物或者免疫缺陷程度有限的裸鼠等作為肝癌動(dòng)物載體，這些動(dòng)物自身具有一定的免疫力，肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到一定的抑制作用，因此很難滿足在新藥研究實(shí)驗(yàn)中對(duì)模型動(dòng)物建模周期短，肝癌惡性程度大的要求。

BALB/c裸鼠是由于基因突變?cè)斐傻模狈Τ墒霻細(xì)胞，但B淋巴細(xì)胞正常。NOD SCID小鼠第16對(duì)染色體上存在單個(gè)隱性突變基因以及VDJ重組酶活性異常，可以阻止功能性T、B淋巴細(xì)胞的分化，造成細(xì)胞和體液免疫功能均缺陷。NOG小鼠由日本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所通過(guò)雜交NOD SCID小鼠和γ-鏈IL-2受體敲除小鼠而建立，這種小鼠主要缺乏T、B淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞。NPG小鼠是維通達(dá)自主研發(fā)的基因缺陷小鼠，也是通過(guò)雜交NOD SCID小鼠和γ-鏈IL-2受體敲除小鼠，與國(guó)外NOG小鼠一致。上述動(dòng)物模型因其存在不同程度的免疫缺陷，在實(shí)際應(yīng)用中也存在一定的差異，如死亡時(shí)間、成瘤大小、腫瘤增殖程度等，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于不同免疫缺陷模型動(dòng)物肝癌模型的比較研究還缺乏數(shù)據(jù)研究。

組別Groups1組BALB/c裸鼠Group 1BALB/c nude mice2組NOD SCID小鼠Group 2NOD SCID mice3組NOG小鼠Group 3NOG mice4組NPG小鼠Group 4NPG mice數(shù)量Number9998平均生存時(shí)間(d)Average survival day26.9±5.528.1±6.318.8±2.6▲△17.5±5.9▲△中位生存時(shí)間(d)Median survival day28272017

注：1組和2組比較，▲P<0.001；1組和2組比較，△P<0.01。

Note. Compared the group 1 with group 2,▲P<0.001. Compared the group 1 with group 2,△P<0.01.

表4 HUH-7及QGY-7703組小鼠死亡情況統(tǒng)計(jì)表Table 4 Mice deaths in the HUH-7 and QGY-7703 groups

表5 HUH-7細(xì)胞及QGY-7703細(xì)胞接種小鼠肝重量統(tǒng)計(jì)表Table 5 Liver weights of the HUH-7 cell-injected mice

注：5組和6組比較，*P<0.05。9組和10組比較，**P<0.05。

Note. The group 5 compared with group 6,*P<0.05. The group 9 compared with group 10,**P<0.05.

注：a： HUH-7細(xì)胞植接種動(dòng)物肝大體觀察照片：第7組(NOG小鼠)和第8組(NPG小鼠)動(dòng)物肝體積顯著大于第5組(BALB/c裸鼠)和第6組(NOD SCID小鼠)動(dòng)物肝。b：QGY-7703細(xì)胞接種動(dòng)物肝大體觀察照片：第11組(NOG小鼠)和第12組(NPG小鼠)動(dòng)物肝體積顯著大于第9組(BALB/c裸鼠)和第10組(NOD SCID小鼠)動(dòng)物肝。除5組和9組外，各實(shí)驗(yàn)組均有部分小鼠在手術(shù)移植肝癌細(xì)胞期間死亡(未形成肝癌結(jié)節(jié))或者在實(shí)驗(yàn)期間意外死亡，未能收集到肝腫瘤標(biāo)本，但是腫瘤結(jié)節(jié)隨免疫缺陷程度增加而逐漸增大。圖3 小鼠肝大體觀察照片Note. a: Livers from HUH-7 cell-injected mice. Liver volumes of group 7 (NOG mice) and group 8 (NPG mice) were significantly greater than those of group 5 (BALB/c nude mice) and group 6 (NOD SCID mice). b: Livers injected with QGY-7703 cells. Liver volumes of group 11 (NOG mice) and group 12 (NPG mice) were significantly larger than those of group 9 (BALB/c nude mice) and group 10 (NOD SCID mice). Except for groups 5 and 9, some mice in each group died during surgical transplantation of hepatocellular carcinoma cells (no hepatocarcinoma nodules were formed) or died unexpectedly during the experimental period. Therefore, hepatic tumor specimens could not be collected. However, tumor nodules were increased gradually with the degree of immunodeficiency.Figure 3 Gross observation of the mouse livers

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同程度免疫缺陷的BALB/c裸鼠、NOD SCID小鼠、NOG小鼠和NPG小鼠原位接種三種人肝癌細(xì)胞并進(jìn)行比較研究。直接注射人肝癌HepG2細(xì)胞后，各組小鼠均在短期內(nèi)發(fā)生死亡，死亡時(shí)間大多在20 d左右。項(xiàng)亮亮等[11]也曾用昆明小鼠注射肝癌H22細(xì)胞建立小鼠肝癌原位和異位移植模型，模型動(dòng)物的平均自然生存期為28 d。王書杰等[12]利用Wistar大鼠將Walker-256瘤株分別進(jìn)行注射、原位移植和改良注射方法制備人源化肝腫瘤模型，結(jié)果顯示模型鼠存活時(shí)間較短，50%以上大鼠在第18天發(fā)生死亡。趙然等[13]利用BALB/c裸鼠進(jìn)行HepG2細(xì)胞皮下接種和原位接種的比較研究，結(jié)果顯示HepG2皮下接種和原位細(xì)胞接種成瘤率均為100%，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)(50 d)未見小鼠發(fā)生死亡。直接注射細(xì)胞法的接種腫瘤細(xì)胞的動(dòng)物生存期一般較短，一般取決于肝癌細(xì)胞惡性增殖的程度(如HepG2細(xì)胞)，惡性程度較高的腫瘤細(xì)胞可使動(dòng)物在短期內(nèi)迅速死亡；另一方面腫瘤細(xì)胞注射后，隨肝血液系統(tǒng)進(jìn)行分散定植，極易形成其它臟器的轉(zhuǎn)移。而惡性增殖程度較低的HUH-7和QGY-7703細(xì)胞，則一般可存活至實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束(大致90天左右)。因此在進(jìn)行抗腫瘤藥物的評(píng)價(jià)時(shí)，需要考慮腫瘤細(xì)胞接種量，動(dòng)物生存期以及給藥途徑和給藥周期。

本實(shí)驗(yàn)中HepG2細(xì)胞組的NOG和NPG小鼠存活時(shí)間要明顯短于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠，可見對(duì)于免疫系統(tǒng)缺陷程度更高的模型鼠來(lái)講，更利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并可以導(dǎo)致模型動(dòng)物快速死亡，縮短實(shí)驗(yàn)研究周期。HUH-7和QGY-7703細(xì)胞組的NOG和NPG小鼠肝重量顯著大于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠，且死亡率也高于BALB/c裸鼠和NOD SCID小鼠，因此NOG和NPG小鼠是更為理想的模型動(dòng)物。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究系統(tǒng)地比較了三種肝癌細(xì)胞直接注射不同免疫缺陷小鼠肝的方法，觀察比較不同動(dòng)物在肝癌細(xì)胞移植后的各種指標(biāo)變化，為抗肝癌藥物的篩選實(shí)驗(yàn)提供了更為科學(xué)的動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究肝癌提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)資料。