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(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣西南寧 530007; 2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心,廣西南寧 530007)

廣西是國內(nèi)最大的甘蔗種植區(qū)和產(chǎn)糖區(qū),甘蔗與蔗糖產(chǎn)量均占全國60%左右[1]。甘蔗含糖量高,是我國主要的制糖原料,其糖分由蔗糖、果糖、葡萄糖三種主要成分構(gòu)成,約占18%～20%[2]。在食品工業(yè)生產(chǎn)中,我國的甘蔗工業(yè)產(chǎn)品比較單一,主要用于制造蔗糖和直接食用。甘蔗不僅富含蔗糖,還含有豐富的維生素以及Fe、Ca、P、Mn、Zn等元素[3-4],具有獨特的甘蔗清香,是釀造果酒的良好原料。

研究發(fā)現(xiàn),直接利用甘蔗汁中蔗糖分可以發(fā)酵制成不同產(chǎn)品,如甘蔗朗姆酒[5]、甘蔗果酒[6-7]、甘蔗醋[8-9]等。果酒發(fā)酵過程中,酵母菌起關(guān)鍵作用,發(fā)酵能力的好壞、副產(chǎn)物的多少,直接影響酒精生產(chǎn)率的高低,間接影響產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)[10]。酵母菌種類不同,同種原料發(fā)酵其生理特性也存在差異,如生長曲線、產(chǎn)酒精能力等[11]。近年來,已有不少甘蔗汁發(fā)酵酵母篩選、工藝方面的研究[12-14],但有關(guān)酵母菌在甘蔗汁中的發(fā)酵特性等報道較少,多數(shù)集中于啤酒發(fā)酵的研究[15-17]。

本研究是在前期試驗的基礎(chǔ)上,篩選出三種不同商用活性干酵母,對新鮮甘蔗汁進行發(fā)酵,探討三種酵母菌發(fā)酵作用甘蔗汁的生長曲線、凝聚性、發(fā)酵度、發(fā)酵力、酸化力和產(chǎn)酒精能力等釀酒特性,以期為甘蔗汁發(fā)酵制備甘蔗果酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗 新臺糖22號,新鮮全莖蔗,無腐爛霉變,由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供;葡萄酒高活性干酵母、耐高溫高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;發(fā)利干酵母 英聯(lián)馬利(北京)食品銷售有限公司,均為市售;乙酸、乙酸鈉、無水硫酸鈣、EDTA-Na、葡萄糖 均為分析純。

YZ220×300甘蔗壓榨機 文山通用機械制造有限責(zé)任公司;搖床、高速離心機 上海博訊實業(yè)有限公司;BIC-300人工氣候箱 上虞艾科儀器設(shè)備有限公司;JY6002型電子天平、JA2003型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;WJ-3A三孔獨立控溫水浴鍋 常州偉嘉;pHS-3C酸度計 上海雷磁儀器廠;酒精計 北京克格儀器有限公司;PAL-1糖度計 日本ATAGO(愛拓)公司;Salvis LAB CN118恒溫生物培養(yǎng)箱 瑞士Salvis公司;WU-CJ-FD潔凈工作臺 蘇州蘇杰凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甘蔗汁和酵母培養(yǎng)液的制備 甘蔗汁:新鮮甘蔗經(jīng)甘蔗壓榨機二次壓榨,混合均勻,120目過濾除雜得到甘蔗汁,備用。

酵母培養(yǎng)液:分別取葡萄酒高活性干酵母、耐高溫高活性干酵母與發(fā)利干酵母三種酵母菌各0.050 g于100 mL無菌水中,置于180 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)10 h使之活化得到培養(yǎng)液,備用。

1.2.2 酵母生長曲線的測定 在無菌操作條件下,取171支無菌的50 mL試管分為A、B、C三組(各組57支待試試管),各組分別加入滅菌的甘蔗汁(含20%無菌水)20 mL,1 mL各種酵母培養(yǎng)液,搖勻后置于180 r/min,30 ℃的恒溫搖床上培養(yǎng),從0 h開始,每2 h取各組待試酵母培養(yǎng)液5 mL稀釋10倍,在560 nm下測定OD560值,以未接種的甘蔗汁為校正比色計的零點,至培養(yǎng)36 h結(jié)束。每個測定值取3個平行點(即取3支待試試管)測定數(shù)據(jù),取其平均值,根據(jù)OD值繪制酵母菌生長曲線。

1.2.3 酵母凝聚性的測定 酵母凝聚值采用光密度改良法測定[18]。取初始表觀糖度為22 °Bx的甘蔗汁1500 mL,滅菌后分別加入葡萄酒高活性干酵母、耐高溫高活性干酵母與發(fā)利干酵母三種酵母培養(yǎng)液,在溫度25 ℃條件下靜置發(fā)酵。每隔24 h取發(fā)酵液于離心機以8000 r/min常溫下離心10 min,至發(fā)酵結(jié)束。沉淀即為酵母泥,收集為待用酵母泥。取待用酵母泥用20 mL EDTA-Na溶液(0.01 mol/L)洗滌1次后,于離心機以3500 r/min常溫下離心10 min,棄去上清液,余下酵母泥再用50 mL去離子水洗滌、常溫下離心2次(3500 r/min,10 min)后,收集酵母泥為備用酵母泥。稱取1.0 g備用酵母泥,轉(zhuǎn)移至50 mL帶塞離心管中,加入乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.5,0.2 mol/L)定容至50 mL,在振蕩器上振蕩5 min后,即刻取4.0 mL于670 nm分光光度計下測光密度OD值。同時將離心管靜置于20 ℃水保溫30 min,在距液面下1 cm處吸取4.0 mL于670 nm分光光度計下測定光密度OD1,以pH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液為空白對照。

計算公式:酵母凝聚值F(%)=(OD-OD1)/OD×100

1.2.4 酵母發(fā)酵力的測定 酵母發(fā)酵力采用CO2失重法測定[19-20]。在專用發(fā)酵瓶中加入150 mL初始表觀糖度為22 °Bx的甘蔗汁,分別加入3 mL各種酵母培養(yǎng)液,接種完畢后,蓋上發(fā)酵栓,25 ℃下恒溫靜置發(fā)酵,稱重發(fā)酵瓶。后每隔24 h稱重一次,稱重前先搖晃發(fā)酵瓶以排去發(fā)酵醪液中的CO2,直至CO2失重<0.2 g,發(fā)酵視為結(jié)束,以CO2失重為縱坐標(biāo),發(fā)酵時間為橫坐標(biāo),繪制發(fā)酵速率曲線。

1.2.5 酵母發(fā)酵度的測定 在專用發(fā)酵瓶中加入150 mL初始表觀糖度為22 °Bx的甘蔗汁,分別加入3 mL各種酵母培養(yǎng)液,接種完畢后,蓋上發(fā)酵栓,恒溫25 ℃下靜置發(fā)酵10 d,酒精度無變化視為結(jié)束。取發(fā)酵液常溫下離心(4000 r/min,15 min)后濾去酵母得到上清液。取50 mL上清液微火熱蒸至原容積的1/3以便除去乙醇,添水恢復(fù)原容積后,冷卻20 ℃下用糖度計測定糖濃度W1。同時用糖度計直接測定20 ℃下上清液的糖濃度W2。

按下列計算公式計算[21]:

真正發(fā)酵度:Wr(%)=(W-W1)×100%/W

外觀發(fā)酵度:Wa(%)=(W-W2)×100%/W

式中:W-發(fā)酵液初始糖度(%);W1-發(fā)酵后排除酒精后的發(fā)酵液濃度(%);W2-發(fā)酵結(jié)束后直接用糖度計直接測定室溫20 ℃下發(fā)酵液的糖度(%)。

1.2.6 酸化力的測定 采用酸化力AP值法測定酵母活力,參考文獻[22]方法并稍作改進。取1.2.3待用酵母泥用4 ℃去離子水洗滌常溫下離心(3500 r/min,10 min)3次,收集沉淀酵母泥備用。稱取1.0 g沉淀酵母泥于100 mL器皿中,加入25 ℃蒸餾水50 mL,以150 r/min攪拌10 min,隨后在酵母懸浮液中加入5 mL葡萄糖溶液(20.2%,w/v),持續(xù)攪拌至20 min時將pH計插到懸浮液中測定pH20,后每隔24 h測定一次,至發(fā)酵結(jié)束。

酸化力(Acidification power,AP)計算公式:AP=6.3-pH20(6.3為水的pH)。

1.2.7 產(chǎn)酒精能力的測定 采用蒸餾法測定[23]。取甘蔗汁,在初始表觀糖度為22 °Bx、酵母添加量為0.5 g/L(質(zhì)量濃度)、溫度25 ℃條件下靜置發(fā)酵,酒精度無變化視為結(jié)束。每隔24 h取100 mL發(fā)酵液于蒸餾瓶中,同時加入100 mL水,混合搖勻后進行蒸餾。當(dāng)置冷凝管下端收集餾出液100 mL,停止蒸餾,搖勻備用。將酒精計和溫度計緩慢置入蒸餾液中,測定溫度和酒精度,查表校正為20 ℃時的酒精度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌的生長曲線

試驗測定三種酵母菌的生長曲線,觀察其生長狀況。預(yù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)10 h后,測定的OD560值大于1.20,改進方法再次稀釋10倍后,測定OD560值,其結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出,0～4 h是三種酵母菌的延緩期,對數(shù)生長期為4～18 h,穩(wěn)定期為18～28 h,28 h后酵母菌開始進入衰亡期。從酵母菌OD值變化可以看出，三種酵母菌生長曲線的趨勢基本一致，其中，葡萄酒高活性干酵母在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期均表現(xiàn)良好。付滿[24]研究采用安琪葡萄酒酵母進行蔗稍汁釀酒的結(jié)果也顯示,延緩期內(nèi)葡萄酒酵母的活性較大,能夠快速適應(yīng)甘蔗汁的營養(yǎng)成分快速起酵,有較好的啟發(fā)性能,且最早達到對數(shù)增長末期。葡萄酒酵母表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能,發(fā)酵過程也較平緩,穩(wěn)定期長,降糖平穩(wěn)。本研究從OD值大小及酵母菌生長曲線的趨勢,特別是在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的變化趨勢,可以看出三種酵母菌的生長穩(wěn)定性為葡萄酒高活性干酵母>耐高溫高活性干酵母>發(fā)利干酵母。

圖1 不同酵母菌的生長曲線Fig.1 The growth curves of different yeasts

2.2 凝聚性的變化

酵母的凝聚性是酵母菌生理特征之一,每一酵母菌均有自身的特定的凝聚性。凝聚性強的酵母,發(fā)酵結(jié)束時沉降早、效率快,發(fā)酵繆液中酵母細胞數(shù)少,能大大降低酵母長時間懸浮于發(fā)酵液中造成自溶的趨勢;凝聚性差的酵母,發(fā)酵結(jié)束時沉降晚、效率慢,酵母細胞仍懸浮于發(fā)酵液中,易造成酵母細胞自溶,酵母發(fā)酵泥回收量低,增加濾酒難度,給生產(chǎn)帶來不便[25]。凝聚值(F值)表示酵母的凝聚程度,凝聚值大小不同,代表酵母的凝聚作用力也有差距,其中F<20%為非凝聚酵母,20%≤F≤80%為中凝聚酵母,F>80%為高凝聚酵母[26]。

三種酵母菌在甘蔗汁的凝聚值變化見圖2。從圖2可知，發(fā)酵48～96 h時,三種酵母菌的凝聚值變化較大,在第72 h時呈現(xiàn)增強的波峰,葡萄酒高活性干酵母的F值為22.11%,可能是因為發(fā)酵過程中酵母處于比較旺盛的生理狀態(tài),在一定程度上增強了凝聚性[27],而在其他發(fā)酵時間段酵母菌的凝聚性均為F<20%,當(dāng)發(fā)酵時間≥96 h時,隨著發(fā)酵時間的延長,酵母凝聚值逐漸降低,其凝聚作用也逐漸減弱。綜合甘蔗汁的發(fā)酵過程變化來看,三種酵母的凝聚值F<20%,均為非凝聚性酵母。

圖2 不同酵母菌在甘蔗汁中凝聚性的變化Fig.2 The change of coagulability of different yeasts in sugarcane juice

2.3 發(fā)酵力的變化

酵母菌發(fā)酵作用甘蔗汁產(chǎn)生酒精,與之同時還伴有CO2的生成,形成的CO2從發(fā)酵醪液中排出,使整個發(fā)酵醪液體系的重量不斷減輕,直至發(fā)酵結(jié)束后保持重量不變[20]。根據(jù)發(fā)酵液失重的程度,可測定發(fā)酵速率的快慢。發(fā)酵力可反映出待篩選酵母的起酵時間、對甘蔗汁的適應(yīng)性、發(fā)酵強度及發(fā)酵過程的動態(tài)變化[15]。三種酵母菌的發(fā)酵力變化見圖3。

由圖3可知,在發(fā)酵過程的前48 h,三種酵母菌的CO2失重量變化最大,說明這一階段發(fā)酵速度快,酵母菌處于繁殖旺盛期,發(fā)酵能力強,其中發(fā)利干酵母的發(fā)酵速度慢于葡萄酒高活性干酵母和耐高溫高活性干酵母;發(fā)酵72 h后三種酵母菌的發(fā)酵速度明顯降低,發(fā)酵96 h后三種酵母菌發(fā)酵過程趨于平緩,發(fā)酵基本結(jié)束。姜加良[28]研究傳統(tǒng)釀造糯米酒中酵母菌的發(fā)酵特性也表明,發(fā)酵的產(chǎn)物之一是CO2,試驗中產(chǎn)生的氣泡數(shù)量越多,氣泡體積越大,酵母的發(fā)酵能力越強,酵母的發(fā)酵速率越快,酵母的發(fā)酵程度越徹底。從總趨勢來看,三種酵母菌發(fā)酵前48 h階段的起酵速度和發(fā)酵力有一定的差異,但在發(fā)酵72 h后時,三種酵母菌的發(fā)酵力是相當(dāng)?shù)摹?/p>

圖3 不同酵母菌對甘蔗汁的發(fā)酵力變化Fig.3 Change of fermentation ability of sugarcane juice with different yeasts

2.4 發(fā)酵度的變化

不同釀酒酵母的菌株在代謝過程中存在差異性,對可發(fā)酵性糖的利用程度也不同。三種酵母菌作用甘蔗汁后的發(fā)酵度變化如圖4所示。從圖4可知,三種酵母菌的真正發(fā)酵度都達到70%以上,但都低于各自的外觀發(fā)酵度,這與張帥等[21]研究蘋果皮中分離到的3種酵母菌的發(fā)酵性能結(jié)果相類似。這是因為外觀發(fā)酵度測定時不考慮酒精、CO2對發(fā)酵的影響,是以糖度計實測外觀殘留濃度計算的,所以測得的發(fā)酵度值比真正發(fā)酵度要高。綜合總體來看,三種酵母菌作用甘蔗汁中的發(fā)酵度高低順序為:葡萄酒高活性干酵母>發(fā)利干酵母≥耐高溫高活性干酵母,這也說明葡萄酒高活性干酵母對可發(fā)酵性糖利用率最高,發(fā)酵后得到的酒精度也會較高。

圖4 不同酵母菌對甘蔗汁的發(fā)酵度變化Fig.4 Change of fermentation degree of sugar cane juice with different yeasts

2.5 酸化力的變化

酸化力(AP)法是在酵母懸液中加入葡萄糖前后測定pH的變化,這種變化與酵母活性及發(fā)酵性能有關(guān)。酵母活力AP值一般為0.15～3.0,AP值愈大,酵母活力愈強,健康強壯的酵母AP值≥2.5,活性較差的酵母AP值一般<1.5。通過測AP值的高低可以判定酵母活力的強弱,對酵母的發(fā)酵性能有較好的預(yù)測作用[29]。但此法中添加的是葡萄糖,相同活力的不同酵母菌株對葡萄糖的代謝能力不同[16]。三種酵母菌不同時間下的酸化力AP值結(jié)果見圖5。

從圖5可知,在發(fā)酵過程中,發(fā)酵1～3 d時,三種酵母菌的AP值降低幅度最大;3～6 d期間,AP值處于波動變化,發(fā)酵6～8 d時,AP值逐漸上升至平穩(wěn)。從發(fā)酵開始到發(fā)酵結(jié)束AP值的變化是先降低再持續(xù)平緩后上升的過程。AP值降低主要是因為CO2的產(chǎn)生和H+的釋放,此外產(chǎn)生的CO2和釋放的H+作為細胞內(nèi)能量被利用會使酵母的活力下降[30]。郭曉明等[31]比較了4種干酵母對香蕉果酒的發(fā)酵特性研究也認為,安琪葡萄酒干酵母優(yōu)于其它干酵母,發(fā)酵過程中酒精度增加速度均較快,在高糖度條件下發(fā)酵能力最好。從三種酵母菌發(fā)酵后期的酸化力的大小來看,葡萄酒高活性干酵母優(yōu)于耐高溫高活性干酵母和發(fā)利干酵母。

圖5 不同酵母菌的酸化能力比較Fig.5 Comparison of acidification ability of different yeast

2.6 產(chǎn)酒精能力的變化

甘蔗果酒生產(chǎn)中,酒精是酵母利用發(fā)酵性糖而產(chǎn)生的,因此把利用發(fā)酵性糖發(fā)酵生成酒精的能力作為衡量優(yōu)良酵母的一項重要指標(biāo)[12],不同釀酒酵母菌株對可發(fā)酵性糖的利用程度不同,最終會導(dǎo)致酒精生成率有較大差別[19]。由圖6可知,三種酵母菌的產(chǎn)酒精能力均隨著發(fā)酵時間的增加而增強,當(dāng)發(fā)酵48～96 h時,葡萄酒高活性干酵母產(chǎn)酒精能力明顯強于耐高溫高活性干酵母和發(fā)利干酵母;當(dāng)發(fā)酵時間>120 h時,三種酵母菌產(chǎn)酒精能力的趨勢相當(dāng),當(dāng)發(fā)酵>216 h時,酵母菌產(chǎn)酒精能力趨于平穩(wěn),發(fā)酵視為結(jié)束。郭曉明等[31]研究同時認為,在發(fā)酵過程中,不同干酵母發(fā)酵的發(fā)酵液酒精度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。因此，不同干酵母生成乙醇的速度各不相同,安琪葡萄酒干酵母酒精生產(chǎn)速度較快,發(fā)酵結(jié)束后酒精度較高。

圖6 不同酵母產(chǎn)酒精能力的比較Fig.6 Comparison of ethanol production by different yeasts

本研究中,從各發(fā)酵階段及總產(chǎn)酒精量來看,三種酵母菌最終產(chǎn)酒精的能力基本相當(dāng),其中葡萄酒高活性干酵母產(chǎn)酒精為12.2%vol,略優(yōu)于耐高溫高活性干酵母和發(fā)利干酵母(12.0%vol)。這也驗證了2.4研究結(jié)果,葡萄酒高活性干酵母在代謝過程中對可發(fā)酵性糖的利用程度較高些,發(fā)酵后得到的酒精度也會相對較高些。付滿[24]研究結(jié)果也驗證了采用安琪葡萄酒酵母對蔗稍汁進行發(fā)酵釀酒,酒精得率高。

3 結(jié)論

通過研究探討葡萄酒高活性干酵母、耐高溫高活性干酵母和發(fā)利干酵母三種商業(yè)酵母菌對甘蔗汁發(fā)酵的釀酒特性分析得到,三種酵母菌作用甘蔗汁的發(fā)酵過程中,酵母菌生長曲線趨勢基本一致,三種酵母的凝聚值F<20%,均為非凝聚性酵母。從OD值、AP值大小及酵母菌生長曲線來看,三種酵母菌的生長穩(wěn)定性和酸化力大小順序為葡萄酒高活性干酵母>耐高溫高活性干酵母>發(fā)利干酵母。綜合發(fā)酵度、發(fā)酵力和產(chǎn)酒精能力三個方面來看,三種酵母菌作用甘蔗汁的發(fā)酵強弱順序為葡萄酒高活性干酵母>發(fā)利干酵母≥耐高溫高活性干酵母。三種酵母菌的發(fā)酵力基本相當(dāng),最終產(chǎn)酒精的能力差距不大,其中葡萄酒高活性干酵母最終產(chǎn)酒精為12.2%vol,耐高溫高活性干酵母和發(fā)利干酵母均為12.0%vol。綜上，三種商用酵母菌作用甘蔗汁的發(fā)酵過程及其釀酒特性存在一定的差異,葡萄酒高活性干酵母略優(yōu)于耐高溫高活性干酵母、發(fā)利干酵母三種酵母菌。三個酵母菌發(fā)酵得到的甘蔗果酒酒精度基本相當(dāng),但如何選用適合釀制甘蔗果酒的優(yōu)勢菌種,下一步將分析不同酵母菌株發(fā)酵果酒香氣成分,結(jié)合感官閾值以及感官分析評價的結(jié)果等,連同甘蔗果酒的營養(yǎng)品質(zhì)、口感風(fēng)味等因素進行綜合考慮與評判。