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(鄭州師范學院生命科學學院，河南 鄭州 450044)

0 引 言

草履蟲( Paramecium ) 是實驗生物學的重要材料，具有分布廣、個體大、易培養(yǎng)、繁殖快等特點，廣泛應用于生物學各個領域的研究[1]，許多實驗都需要飼養(yǎng)草履蟲來進行，如何在最短的時間內(nèi)得到大量、性狀穩(wěn)定的草履蟲是大家普遍關心的問題，同時一些新的研究內(nèi)容也對草履蟲的生理和形態(tài)提出了嚴格的要求[2,3]。用于培養(yǎng)草履蟲的培養(yǎng)液有稻草培養(yǎng)液、酵母培養(yǎng)液、小麥培養(yǎng)液、蛋黃培養(yǎng)液、牛奶培養(yǎng)液等，其中稻草培養(yǎng)液相較于其他幾種培養(yǎng)液能較長時間維持草履蟲生長環(huán)境的穩(wěn)定，特別是pH值的穩(wěn)定[7,8]。本實驗通過向稻草培養(yǎng)液中加入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌及金黃色葡萄球菌四種廣泛存在于自然界的細菌喂飼尾草履蟲(Paramecium Caudatum)，探討了不同細菌對尾草履蟲種群增長的影響。

1 材料與方法

1.1 尾草履蟲的采集與純化

野外環(huán)境中采集的水樣靜置2h，通過濾紙漏斗過濾，將濾紙置于新鮮稻草培養(yǎng)液中培養(yǎng)5-7d，待達到一定數(shù)量后解剖鏡下用微吸管吸取草履蟲置于分裝有100 mL新鮮培養(yǎng)液的三角瓶中25 °C培養(yǎng)5d，連續(xù)1-2 次純培養(yǎng)后于顯微鏡低倍鏡下隨機10次鏡檢[8,9]，若無其他原生生物的檢出即可留種備用，否則需重復上述純化操作。

1.2 培養(yǎng)液的配置

1.2.1 稻草培養(yǎng)液

每1000 mL水加10 g稻草煮沸15 min, 冷卻過濾后定容到1000 mL，分裝到250 mL三角瓶，每瓶100 mL，1×105Pa滅菌20min，冷卻備用。

1.2.2 菌液的配置

分別接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌到營養(yǎng)瓊脂平板(90 mm)，37 °C培養(yǎng)24 h，每個平板注入無菌水10mL，充分洗脫培養(yǎng)基上的4種細菌，制成菌懸液備用。

1.3 接種與培養(yǎng)

向上述1.2.1中三角瓶內(nèi)分別接種草履蟲50個，每組5瓶，每組1號瓶注入1 mL無菌水，2-5號瓶分別注入1 mL大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，混勻，重復5組。瓶口覆蓋無菌紗布4層包扎，日光燈照射，25℃條件下培養(yǎng)。

1.4 計 數(shù)

每天定時取樣計數(shù)。每瓶隨機取樣5次，每次0.1 mL，于凹玻片中，滴入盧戈氏碘液殺死草履蟲并染色，解剖鏡下計數(shù)，5組重復樣品取平均值，計算1 mL培養(yǎng)液中草履蟲的密度(ind/mL)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

通過測得數(shù)據(jù)計算尾草履蟲的種群增長速率。

尾草履蟲的種群增長速率計算公式：Y= ( lnNt-lnN0) .t-1， 其中N0為尾草履蟲的起始種群密度，Nt為t(d) 時尾草履蟲的種群密度，t為培養(yǎng)持續(xù)時間(d)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細菌培養(yǎng)液對尾草履蟲種群密度的影響分析

喂飼不同細菌尾草履蟲種群密度如表1所示，相較于對照組，喂飼大腸桿菌可以獲得最大種群密度的草履蟲，其較大的種群密度維持時間最長；蠟樣芽胞桿菌最高種群密度僅次于大腸桿菌，但其數(shù)量只有大腸桿菌的1/2；枯草芽孢桿菌達到最高種群密度次于蠟樣芽胞桿菌；金黃色葡萄球菌對草履蟲的生長抑制最為明顯，最高種群密度最小，與對照組差別不大，但數(shù)量后期波動較大，密度下降也最快。

表1 不同細菌培養(yǎng)液中草履蟲種群密度的影響

接種草履蟲后第1d檢測到草履蟲的為大腸桿菌培養(yǎng)液，第2d起各培養(yǎng)液中均可以檢測到不同數(shù)量的草履蟲，第3d草履蟲種群密度最大的為蠟樣芽胞桿菌(509 ind/mL)，枯草芽孢桿菌次之(216 ind/mL)，金黃色葡萄球菌(144 ind/mL)緊隨其后，大腸桿菌(86 ind/mL)與對照組(83 ind/mL)差別不明顯，第4d開始不同培養(yǎng)液中草履蟲的種群密度均增長較快，且出現(xiàn)分化。

大腸桿菌培養(yǎng)液中草履蟲的種群密度第5d開始一直領先于其他三種菌，并于第6 d達到峰值(2834 ind/mL)，第7 d種群密度下降較快，但仍高于其他菌種，第8d開始密度緩慢下降，隨培養(yǎng)時間的增加，草履蟲個體活動并未明顯減緩，形態(tài)仍較其他培養(yǎng)液大，直至第11 d時鏡檢發(fā)現(xiàn)少量草履蟲開始形成包囊，碘液染色開始變淡。

枯草芽胞桿菌培養(yǎng)液中草履蟲其種群密度于第5d達到1236 ind/mL后緩慢下降，第9 d時草履蟲體型細長，活動緩慢，碘液處理染色淡，少量草履蟲開始形成包囊。 蠟樣芽胞桿菌培養(yǎng)液中草履蟲其種群密度于第5d達到1334 ind/mL后進入緩慢下降，第8 d時草履蟲體型細長，活動緩慢，碘液處理染色較淡，少量草履蟲開始形成包囊。

金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中草履蟲的種群密度在培養(yǎng)前期與對照組無太大差別，但后期種群密度下降較為明顯，在所有組中，其草履蟲的活躍度最差，被染色能力最差，第8 d已經(jīng)形成大量包囊，而對照組第8d僅少量草履蟲開始形成包囊。

2.2 不同細菌培養(yǎng)液對尾草履蟲種群增長速率的影響分析

表2所示，培養(yǎng)第1d，僅大腸桿菌培養(yǎng)液中出現(xiàn)草履蟲的增長；第2-5d，對照組的增長速率均低于其他培養(yǎng)液，暗示在添加細菌有利于維持草履蟲的穩(wěn)定增長，特別是蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液對草履蟲前期增長速率的影響最大；第6-10d，大腸桿菌培養(yǎng)液中草履蟲的整體增長速率高于對照組和其他培養(yǎng)液；第5d開始金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中草履蟲的增長速率低于對照組和其他三種培養(yǎng)液，暗示金黃色葡萄球菌在草履蟲生長后期可能具有抑制作用。

表2 不同細菌培養(yǎng)液中草履蟲種群增長速率的影響

2.3 不同細菌培養(yǎng)液對尾草履蟲接合生殖的影響

不同的細菌培養(yǎng)液對草履蟲的增殖方式有一定的影響，表3所示，在首次檢測到接合生殖開始每2 h進行1次鏡檢，每天取最高數(shù)量的接合生殖個數(shù)進行計數(shù)，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液最有利于草履蟲接合生殖的發(fā)生，其次是蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液也檢出一定數(shù)量的接合生殖，均較對照組檢出率高。

表3 不同細菌培養(yǎng)液中草履蟲接合生殖的影響

3 結(jié) 語

實驗結(jié)果顯示：不同細菌對草履蟲種群密度的增長及繁殖方式均影響，其中大腸桿菌對種群密度的增長及維持高密度的種群數(shù)量效果最為明顯，且草履蟲長時間內(nèi)均能保持活躍狀態(tài)，形體變異少；而蠟樣芽孢桿菌則有利于草履蟲早期種群密度的建立；在進入快速增殖時期后枯草芽孢桿菌與對照組沒有明顯的差別，但對照組維持穩(wěn)定的種群密度要長，這可能與對照組稻草培養(yǎng)液中芽孢的萌發(fā)有關；金黃色葡萄球菌在草履蟲培養(yǎng)后期對草履蟲的增殖有一定的抑制作用，不排除其代謝產(chǎn)物的積累對草履蟲生長產(chǎn)生影響。

實驗處理中發(fā)現(xiàn)碘液處理活躍程度不同的草履蟲其染色顏色深淺不同，草履蟲越活躍，染色越深，反之越淺，推測這可能與其體內(nèi)代謝產(chǎn)物有一定的關系。

接種到新鮮培養(yǎng)液中的草履蟲其早期的增殖方式以分裂生殖為主，過低的種群密度會降低草履蟲相互接觸的幾率，因此在培養(yǎng)初期幾乎檢測不到草履蟲的接合生殖。隨著群密度的增高，接合生殖出現(xiàn)的幾率越高，但過高的種群密度并不一定能增加分裂生殖出現(xiàn)的數(shù)量(表1、3)。實驗結(jié)果表明，相較于其他3種細菌，枯草芽孢桿菌似乎更能刺激草履蟲接合生殖的發(fā)生，但具體原因還有待于進一步的研究。