姜艷紅,陳光意，盛家和，許青霞

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450008)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由于造血干細(xì)胞發(fā)生了染色體畸變、融合基因形成和/或同時(shí)存在體細(xì)胞突變等異常事件，導(dǎo)致正常造血干細(xì)胞的增殖失控、分化受阻及調(diào)控異常，從而促使其惡性轉(zhuǎn)化并且無限增殖的一類高度異質(zhì)性血液系統(tǒng)疾病。神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(CD56)抗原是存在于細(xì)胞表面的一種糖蛋白，屬于免疫球蛋白超基因家族，主要在自然殺傷細(xì)胞和部分T 細(xì)胞表面上表達(dá)，是自然殺傷細(xì)胞特異性分化抗原，與細(xì)胞黏附有一定關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道15%～35% 的AML患者可表達(dá)CD56[1]。本文通過對(duì)比分析CD56+與CD56-初治原發(fā)AML常見臨床特征的差異，為AML的診斷分型、治療選擇、隨訪監(jiān)測(cè)、預(yù)后估計(jì)及發(fā)病機(jī)制的探討提供參考數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1月至2016年12月河南省腫瘤醫(yī)院血液科所有初治原發(fā)AML住院患者232例，所有患者經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)分析，AML診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)參照WHO[2]和張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[3]，排除骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)化型AML、治療相關(guān)AML及其他類型非原發(fā)AML和非初治AML患者，最終選出144例資料完整的AML患者納入本研究。本研究均獲得患者知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1血常規(guī)檢查 抽取患者外周靜脈血2 mL并用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，用Sysmex-3000血常規(guī)分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢查。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 抽取骨髓液制涂片，快速干燥后進(jìn)行瑞氏染色，根據(jù)需要進(jìn)行特殊細(xì)胞化學(xué)染色，包括過氧化物酶、堿性磷酸酶、特異性酯酶、非特異性酯酶及糖原染色等，進(jìn)行形態(tài)學(xué)分型。

1.2.3免疫學(xué)分型檢查 抽取骨髓液2 mL并用肝素抗凝，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和熒光標(biāo)記的單克隆抗體檢測(cè)白血病細(xì)胞的表面抗原，并通過計(jì)算幼稚細(xì)胞抗原的表達(dá)比例來確定陽性細(xì)胞數(shù)；以細(xì)胞膜抗原表達(dá)大于或等于20%，細(xì)胞質(zhì)抗原表達(dá)大于或等于10%為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算抗原的陽性率。

1.2.4細(xì)胞遺傳學(xué)檢查 通過骨髓細(xì)胞直接法和(或)24 h培養(yǎng)法，按照常規(guī)制備染色體，正常核型至少要分析20個(gè)分裂象，異常核型至少要分析10個(gè)分裂象。核型異常描述依據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 2013)》的規(guī)定進(jìn)行[4]。

1.2.5分子生物學(xué)檢查 通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)AML1-ETO、PML-RARα、CBFβ/MYH11等13種AML相關(guān)融合基因，采用二代測(cè)序方法檢測(cè)NPM1、FLT3-ITD、FLT3-TKD等53種AML相關(guān)基因突變。

2 結(jié) 果

2.1一般臨床特點(diǎn)分析 144例初治AML患者，其中男76例，女68例，正常核型59例(40.97%)，異常核型85例(59.03%)；按照FAB分型標(biāo)準(zhǔn)，M1型11例、M2a型38例、M2b型26例、M3型21例、M4型2例、M5型45例、M6型1例；既往病史包括高血壓5例、糖尿病2例、皮膚病1例、胃炎1例、前列腺炎1例、乳腺炎1例、乳腺癌1例、肝炎1例、痛風(fēng)1列、腦梗死1例、過敏性哮喘1例；根據(jù)患者免疫分型檢查是否有CD56表達(dá)，分為CD56+組與CD56-組，一般臨床特點(diǎn)見表1，CD56+組與CD56-組初治原發(fā)AML相比較，易出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，而少見乏力和出血，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.064，4.704,5.262；P=0.044，0.030，0.022；P<0.05)；性別、年齡、既往病史和常見臨床癥狀的面色蒼白、肢體疼痛與牙齦受侵在兩組中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 CD56+與CD56-初治原發(fā)AML一般臨床特征

a:通過連續(xù)校正法計(jì)算得出的P值

2.2血細(xì)胞常規(guī)和骨髓細(xì)胞形態(tài)分析 骨髓中原始細(xì)胞比例，外周血中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)和血小板(PLT)的量在CD56+和CD56-組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3FAB分型分析 按FAB分型，納入研究的144例患者中伴CD56+的AML在M1、M2a、M2b、M3、M4、M5和M6組所占比例分別為54.55%、31.58%、61.54%、9.52%、0、26.67%和0；CD56+組與CD56-組初治原發(fā)AML相比較，有較高比例的M2b型，較低比例的M3型AML，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.359、6.272；P=0.001、0.012；P<0.05)；而在M1、M2a、M4、M5和M6型AML中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2 CD56+與CD56-初治原發(fā)AML血細(xì)胞常規(guī)和骨髓細(xì)胞形態(tài)分析

表3 CD56+與CD56-初治原發(fā)AML的FAB分型分析

a：通過連續(xù)校正法計(jì)算得出的P值，b：通過確切概率法直接計(jì)算得出的P值

2.4細(xì)胞遺傳學(xué)分析 染色體核型按對(duì)預(yù)后影響進(jìn)行分組，分為預(yù)后良好、預(yù)后中等和預(yù)后不良組，預(yù)后不良組按復(fù)雜核型和單體核型的有無分組，CD56+組與CD56-組初治原發(fā)AML相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表4。

2.5融合基因分析 納入研究的144例患者，檢測(cè)到的常見融合基因有AML-ETO、PML-RARA、CBFβ-MYH11和MLL-ELL，CD56+AML患者在伴有以上融合基因患者中所占比例分別61.54%、9.52%、0和0；CD56+組與CD56-組初治原發(fā)AML相比較，AML-ETO在CD56+組所占比例高于CD56-組，PML-RARA在CD56+組所占比例低于CD56-組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；而CBFβ-MYH11和MLL-ELL在CD56+組和CD56-組所占比例的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表5。

表4 CD56+與CD56-初治原發(fā)AML細(xì)胞遺傳學(xué)分析

a：通過連續(xù)校正法計(jì)算得出的P值

2.6基因突變分析 對(duì)144例入選患者進(jìn)行基因突變檢測(cè)，共檢測(cè)到33種突變基因，DNMT3A和IKZF1突變?cè)贑D56+組中分別為0例和6例(75.00%)，而在CD56-組分別為11例(100.00%)和2例(25.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.442、4.781；P=0.035、0.029；P<0.05)；除去以上2種突變基因，其他31種突變基因在CD56+組和CD56-組組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

表5 CD56+與CD56-初治原發(fā)AML融合基因分析

續(xù)表5 CD56+與CD56-初治原發(fā)AML融合基因分析

a：通過連續(xù)校正法計(jì)算得出的P值，b：通過確切概率法直接計(jì)算得出的P值

表6 CD56+與CD56-初治原發(fā)AML基因突變分析

續(xù)表6 CD56+與CD56-初治原發(fā)AML基因突變分析

a：通過連續(xù)校正法計(jì)算得出的P值，b：通過確切概率法直接計(jì)算得出的P值

3 討 論

CD56主要在NK細(xì)胞和部分T 細(xì)胞表面上表達(dá)，是NK細(xì)胞特異性分化抗原，與細(xì)胞黏附有一定關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道15%～35%的AML患者可表達(dá)CD56[5]。本研究144例AML患者中，有48例伴有CD56表達(dá)(33.33%)，與文獻(xiàn)相符。有研究顯示CD56 的表達(dá)與AML 患者療效呈負(fù)相關(guān)，為預(yù)后不良因素[6]。

本研究中CD56+組男性患者所占比例(47.92%)低于女性(52.08%)，而CD56-組男性(52.08%)高于女性(44.79%)，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.409)，可見伴不伴有CD56表達(dá)并不受性別的影響。白血病發(fā)病的機(jī)制為基因位點(diǎn)改變而導(dǎo)致一些系列特異性基因在本不該表達(dá)的情況下被錯(cuò)誤地表達(dá)出來，而基因位點(diǎn)改變主要受機(jī)體內(nèi)在因素和外界環(huán)境因素的影響。患者年齡越大，受到這兩種因素影響的機(jī)會(huì)就越大，那么基因位點(diǎn)的改變的概率就大。本研究發(fā)現(xiàn)在不同年齡分組中，CD56+與CD56-患者所占比例差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.365)。常見病如高血壓、糖尿病、皮膚病、胃炎、前列腺炎、乳腺炎、肝炎等，在CD56+與CD56-組所占比例均較低，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.616)，可見既往病史的常見病并不是CD56跨系表達(dá)的影響因素。本文中有發(fā)熱的AML患者在CD56+組所占比例(56.25%)高于CD56-組(38.54%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044)，究其原因，可能是表達(dá)CD56的白血病細(xì)胞會(huì)引起某種內(nèi)生致熱源(EP)的升高而導(dǎo)致發(fā)熱。貧血常引起乏力，而白血病患者多伴有貧血，患者常感乏力，本研究發(fā)現(xiàn)有乏力的AML患者在CD56+組所占比例(27.08%)低于CD56-組(45.83%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)，可能是由于伴有CD56表達(dá)的AML患者貧血較輕的原因，這與本文關(guān)于AML患者外周血Hb的分析是一致的(CD56+組Hb有高于CD56-組的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。面色蒼白是貧血的主要表現(xiàn)，雖然CD56+組所占比例低于CD56-組，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.898)，可能是由于本研究病例少，統(tǒng)計(jì)量代表性不好。出血是白血病的常見癥狀，而本文數(shù)據(jù)顯示，出血患者在CD56+組所占比例(10.42%)低于CD56-組(27.08%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)，這與本文關(guān)于AML的FAB分型的分析中CD56-組AML-M3病例所占比例高是一致，M3患者往往伴有出血。白血病患者出現(xiàn)肢體疼痛是骨髓中白血病細(xì)胞大量增殖而引起骨髓腔中壓力過大造成的，本研究發(fā)現(xiàn)，兩組間出現(xiàn)肢體疼痛患者所占比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.055)，說明二者的骨髓增生程度沒太大差別，這與本文關(guān)于骨髓原始細(xì)胞比例分析結(jié)果是一致的。有研究認(rèn)為伴CD56表達(dá)的AML一般分化較差，容易出現(xiàn)髓外浸潤[7]。本文對(duì)AML患者有無牙齦受侵進(jìn)行了分析，并未發(fā)現(xiàn)CD56+組和CD56-組存在太大差異(P=0.708)，與上述文獻(xiàn)不符，但與本文關(guān)于AML的FAB分型中AML-M5在兩組中所占比例的分析是一致的，AML-M5常常伴有牙齦受侵。

本研究中盡管CD56+組的骨髓原始細(xì)胞比例、外周血RBC和PLT的量有低于CD56-組的趨勢(shì)，而外周血WBC和Hb有高于CD56-組的趨勢(shì)，但兩組間的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，這可能與CD56的生理功能有關(guān)，CD56抗原是存在于細(xì)胞表面的一種糖蛋白，屬于免疫球蛋白超基因家族， 富含聚唾液酸，可形成一種高腺苷酸屏障，降低細(xì)胞的黏附力，使腫瘤細(xì)胞更易侵襲性生長?？梢奀D56與AML患者白血病細(xì)胞的髓外侵襲性有關(guān)，而對(duì)骨髓的增殖并無影響，所以CD56+組與CD56-組間骨髓原始細(xì)胞比例和外周血WBC、RBC、Hb和PLT的差別不大。

有文獻(xiàn)報(bào)道15%～35% 的AML 患者可表達(dá)CD56，主要在M1、M2、M5 中表達(dá)[4]；按FAB分型，本文納入研究的144例患者中伴CD56+的AML在M1、M2(包括M2a和M2b)、M3、M4和M6組所占比例分別為54.55%、43.75%、9.52%、0、26.67%和0，可見CD56在M1中表達(dá)最高，其次是M2、M5，與上述文獻(xiàn)相符。但通過對(duì)AML的FAB分型的各亞型在CD56+組和CD56-組所占的比例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)M2b型在CD56+組所占比例高于CD56-組，而M3型在CD56+組所占比例低于CD56-組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、0.012)，這與本文關(guān)于這兩亞型特有的融合基因的分析結(jié)果是一致的；而其他亞型在CD56+組和CD56-組所占比例間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究把染色體核型按照對(duì)預(yù)后的影響進(jìn)行分組，分為預(yù)后良好、預(yù)后中等和預(yù)后不良組，預(yù)后不良組按有無復(fù)雜核型和單體核型進(jìn)行分組，CD56+組與CD56-組初治原發(fā)AML患者各種核型所占比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與上述文獻(xiàn)不符，究其原因，可能是AML的細(xì)胞遺傳學(xué)異常研究的分組標(biāo)準(zhǔn)與本研究的不同所造成的。

IRIYAMA等[8]的研究結(jié)果顯示伴AML-ETO的AML患者中，CD56表達(dá)率約為65%，高于AML其他亞型CD56的平均表達(dá)水平，且CD56表達(dá)是評(píng)估該類AML患者病情復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因子[7]；MONTESIONS等[9]發(fā)現(xiàn)，APL白血病細(xì)胞若表達(dá)CD56，則患者治療效果差，無進(jìn)展生存期較短，總生存期縮短[9]。納入研究的144例患者，檢測(cè)到的常見融合基因有AML-ETO、PML-RARA、CBFβ-MYH11和MLL-ELL，CD56+AML患者在伴有以上融合基因患者中所占比例分別61.54%、9.52%、0和0；可見CD56在伴有AML-ETO的AML患者中表達(dá)的頻率與有學(xué)者的研究結(jié)果接近。結(jié)合本文前面關(guān)于AML的FAB分型各亞型的分析，CD56在伴有AML-ETO的AML-M2b患者中表達(dá)的頻率最高，與有學(xué)者的研究結(jié)果相符合。但通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CD56+組與CD56-組初治原發(fā)AML相比較，AML-ETO在CD56+組所占比例高于CD56-組，PML-RARA在CD56+組所占比例低于CD56-組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；而CBFβ-MYH11和MLL-ELL在CD56+組和CD56-組所占比例的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，結(jié)合前面關(guān)于AML的FAB分型，可得出CD56在AML中的跨系表達(dá)，易見于伴有重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常的AML-M2b，而少見于伴有重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常的AML-M3。

近年研究證實(shí)，DNMT3A(DNAmethyltransferase 3A， DNMT)與實(shí)體腫瘤及血液惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在白血病細(xì)胞株和急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合征患者中均有異常表達(dá)[10]。約11%～35%正常核型AML患者具有該類突變。多項(xiàng)臨床研究顯示合并DNMT3A基因突變的AML患者預(yù)后較差，DNMT3A突變往往與FLT3-ITD/NPM1突變共存在[11]。本文144例患者中，發(fā)生DNMT3A突變的有11例，占所有患者的7.64%；正常核型有59例，發(fā)生DNMT3A突變的有10例，占正常核型AML的16.95%，與上述文獻(xiàn)相符。但這11例DNMT3A突變患者全都不伴有CD56表達(dá)，與CD56+組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)。IKZF1基因表達(dá)于造血干細(xì)胞、所有的淋巴細(xì)胞及部分髓系細(xì)胞。IKZF1突變發(fā)生于基因組水平，是ALL發(fā)病的一個(gè)重要促進(jìn)因素，也是ALL患者獨(dú)立的預(yù)后不良因素[12]。IKZF1突變?cè)诩毙运栊园籽≈械耐蛔兦闆r鮮有報(bào)道，本組資料144例AML患者中，48例伴有CD56表達(dá)的患者中有6例發(fā)生IKZF1基因突變，而96例不伴有CD56表達(dá)的患者中僅有2例發(fā)生IKZF1基因突變，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)。通過以上分析，可以發(fā)現(xiàn)伴有CD56表達(dá)的AML患者，易見IKZF1基因突變，而較少見DNMT3A基因突變，至于它們之間的相關(guān)性，有待于進(jìn)一步收集更多病例進(jìn)行分析。

綜上所述，與CD56陰性初治原發(fā)AML患者相比，CD56陽性AML患者易見發(fā)熱癥狀，伴有重現(xiàn)性遺傳異常的AML-M2b和IKZF1基因突變；而少見乏力和出血癥狀，伴有重現(xiàn)性遺傳異常的AML-M3和DNMT3A基因突變。