蘇來金，馬麗萍，劉 慧，周德慶,*

（1.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室，海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 溫州 325006）

諾如病毒（noroviruses，NoVs）是世界范圍內(nèi)重要的食源性病原體，可以分為7 個基因型（GI～GVII），其中GI和GII主要感染人類，也可以通過食源和水源進(jìn)行傳播[1-3]，大多數(shù)NoVs感染是由GII.4 NoV引發(fā)的[4]。近年來，食源性NoVs感染頻繁出現(xiàn)，許多NoVs疫情的爆發(fā)都與食用牡蠣有關(guān)[5-8]，給食品安全和貿(mào)易帶來了巨大威脅。由于牡蠣等雙殼貝類的濾食特性，加上生食牡蠣的消費(fèi)習(xí)慣，牡蠣成為世界上公認(rèn)的NoVs重要傳播載體。

通常NoVs通過污染的海水進(jìn)入牡蠣體內(nèi)[9]，研究表明NoVs在牡蠣體內(nèi)的積累具有持續(xù)性和穩(wěn)定性，因此很難被凈化[10-11]，且其檢出存在明顯的季節(jié)性差異。牡蠣中經(jīng)常有不同基因型的NoVs被檢出，這些不同型別的NoVs并不是相似地積累在牡蠣的某一個組織部位[12-14]，這使得牡蠣中NoVs的研究變得比較復(fù)雜。摸清NoVs在牡蠣中的蓄積、分布、特異性結(jié)合機(jī)理，可以有針對性地開展NoVs檢測和制定NoVs凈化方案，對于NoVs控制和風(fēng)險預(yù)警均有重要的參考意義。對于牡蠣中NoVs的積累和分布，前期研究主要通過采集牡蠣樣品檢測為主[15-16]，但是采集養(yǎng)殖或野生的牡蠣檢測受到其生長環(huán)境、NoVs污染源、樣品采集數(shù)量和代表性等不確定因素的影響，導(dǎo)致牡蠣中NoVs積累和分布規(guī)律研究進(jìn)展緩慢。本研究采取實(shí)驗(yàn)室內(nèi)控制環(huán)境條件，人工污染GII.4 NoV養(yǎng)殖牡蠣的方法，分組織、分時間進(jìn)行定量和定位檢測，以期探索牡蠣中NoVs分布特征和變化情況，為牡蠣中NoVs的分布規(guī)律和特異結(jié)合機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2014年10月于山東乳山養(yǎng)殖基地采集養(yǎng)殖太平洋牡蠣（Crassostrea gigas），貝齡為2 年，個體大小均勻，有活力，經(jīng)實(shí)時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法隨機(jī)檢測[17]，未檢測到NoVs，運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室放入純凈海水中暫養(yǎng)待用。實(shí)驗(yàn)用NoVs陽性毒株為GII.4型（GenBank登錄號為EU839594），由中國疾病預(yù)防中心提供，經(jīng)過超速梯度離心純化后待用。海水取自青島沿海，鹽度約為30‰，經(jīng)過滅菌和過濾后待用，其他鹽度的海水通過濃縮或者純凈水稀釋海水獲得。

Anti-Norovirus GII.4+GII.15免疫組織化學(xué)抗體艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG免疫組織化學(xué)二抗 美國Abbkine公司；即用型SABC-POD試劑盒、DAB染色試劑盒 武漢德士生物工程有限公司；病毒RNA提取試劑盒 瑞士Roche公司；一步法實(shí)時熒光定量RT-PCR試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司；RXZ-600型人工氣候箱 寧波江南儀器廠；RM2235組織切片機(jī)德國Leica公司；MSM自動組織切片染色機(jī) 德國SLEE公司；CX31-LV320顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社。

1.3 方法

1.3.1 NoVs污染實(shí)驗(yàn)

取1 mL一定濃度的GII.4 NoV，加入盛裝1 000 mL海水的養(yǎng)殖容器中，攪拌均勻，放入3 只有活力的太平洋牡蠣，在不同條件下進(jìn)行牡蠣養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，通氧養(yǎng)殖一定時間后，取出牡蠣，用潔凈海水沖洗，分割不同的牡蠣組織，用實(shí)時熒光定量RT-PCR方法檢測GII.4 NoV的含量[17]，同時合并養(yǎng)殖與沖洗海水，檢測海水中GII.4 NoV的含量。

1.3.2 NoVs污染濃度的確定

病毒經(jīng)過實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測其濃度后，將原液用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）分別稀釋10、100 倍和1 000 倍，與病毒原液一起作為4 個病毒濃度梯度，分別開展病毒污染牡蠣養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)，通氧養(yǎng)殖24 h后，取整體牡蠣進(jìn)行GII.4 NoV回收，檢測其含量，并按照下式計算牡蠣中GII.4 NoV回收率。

1.3.3 海水中NoVs的穩(wěn)定性測定

取適量的GII.4 NoV加入鹽度30‰、溫度20 ℃海水中，保持通氧狀態(tài)，設(shè)置時間0、6、12、24 h 共4 個實(shí)驗(yàn)組，每組3 個重復(fù)，檢測不同時間條件下海水中GII.4 NoV含量變化。

1.3.4 不同溫度下NoVs污染牡蠣養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

取適量的GII.4 NoV污染牡蠣進(jìn)行養(yǎng)殖，海水鹽度30‰，養(yǎng)殖海水溫度分別設(shè)定為5、10、15、20、25、30 ℃共 6 個實(shí)驗(yàn)組，每組3 個重復(fù)，通氧養(yǎng)殖24 h后，檢測不同牡蠣組織部位與海水中的GII.4 NoV含量。

1.3.5 不同鹽度下NoVs污染牡蠣養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

取適量的GII.4 NoV污染牡蠣進(jìn)行養(yǎng)殖，海水溫度20℃，鹽度分別調(diào)整為10‰、20‰、30‰、40‰共4 個實(shí)驗(yàn)組，每組3 個重復(fù)，通氧養(yǎng)殖24 h后，檢測不同牡蠣組織部位與海水中的GII.4 NoV含量。

1.3.6 不同時間牡蠣體內(nèi)NoVs變化遷移

取適量的GII.4 NoV污染牡蠣進(jìn)行養(yǎng)殖，海水溫度20 ℃、鹽度30‰條件下通氧養(yǎng)殖，養(yǎng)殖時間設(shè)0、1、2、6、12、24 h共 6 個實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3 個重復(fù)，檢測不同牡蠣組織部位與海水中的GII.4 NoV含量。

1.3.7 凈化對牡蠣中NoVs含量的影響

取適量的GII.4 NoV污染牡蠣進(jìn)行養(yǎng)殖，海水溫度20 ℃、鹽度30‰條件下通氧養(yǎng)殖24 h后，再將牡蠣放入潔凈的海水中，繼續(xù)養(yǎng)殖6、12、24 h，每6 h更換一次潔凈海水，檢測不同牡蠣組織部位與海水中GII.4 NoV的含量。

1.3.8 牡蠣組織中NoVs的定位

牡蠣組織中GII.4 NoV的分布用免疫組織化學(xué)方法定位，按照文獻(xiàn)[18]的方法稍加修改。牡蠣剝殼組織分離后，不同部位在體積分?jǐn)?shù)10%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，切5 μm薄片，用PBS在室溫下清洗3 次，每次5 min，4 ℃放置過夜，使用SABC-POD試劑盒按照說明書進(jìn)行操作，染色按照DAB試劑盒說明進(jìn)行。免疫反應(yīng)后，用電子顯微鏡拍照分析，顏色分成4 個評價等級：非常強(qiáng)（強(qiáng)烈的紅棕色，+++）、強(qiáng)（明顯的棕色，++）、弱（較淺的棕色，+）或者陰性（無棕色，-）。

1.3.9 牡蠣不同組織部位的分離

將養(yǎng)殖后的牡蠣在無菌狀態(tài)下進(jìn)行組織分離，分成外套膜、鰓、內(nèi)臟團(tuán)3 個部分，分別放入無菌容器待檢測。

1.3.10 NoVs回收與定量檢測

牡蠣與海水中的GII.4 NoV回收、病毒RNA提取和實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測按照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NoVs污染濃度的確定

從表1中可以看出，不同濃度的GII.4 NoV在牡蠣組織中均有檢出。在高濃度時，海水中有GII.4 NoV檢出，此時牡蠣GII.4 NoV回收率為17.20%，說明此時病毒濃度過高，24 h后尚不能被牡蠣全部富集。牡蠣中GII.4 NoV的回收率在稀釋10 倍時達(dá)到最高，為23.42%；稀釋100 倍的回收率為21.6%?？紤]到陽性病毒資源缺乏，并且106拷貝數(shù)量級在實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測中呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，因此，本研究其他實(shí)驗(yàn)選擇稀釋100 倍的GII.4 NoV作為人工污染實(shí)驗(yàn)的病毒濃度，即加入1 mL濃度為（8.24±0.17）×106拷貝數(shù)/mL（由實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測得到）的GII.4 NoV稀釋液。

表1 不同濃度GII.4 NoV污染牡蠣情況Table1 Amount of NoV in oyster contaminated with GII.4 NoV at different concentrations

2.2 海水中NoVs的穩(wěn)定性

表2 GII.4 NoV在海水中的穩(wěn)定性Table2 Stability of GII.4 NoV in seawater

從表2中可以看出，加入海水0、6、12、24 h后，GII.4 NoV含量沒有明顯的變化（P＞0.05），說明GII.4 NoV在海水中具有良好的穩(wěn)定性。

2.3 不同溫度下NoVs在牡蠣組織中含量的變化

圖1 不同溫度下GII.4 NoV在牡蠣組織中的含量Fig.1 Contents of GII.4 NoV in oyster tissues at different temperatures

從圖1中可以看出，在5 ℃時，牡蠣代謝緩慢，此時GII.4 NoV主要在養(yǎng)殖海水中，在牡蠣鰓和外套膜中檢出少量的GII.4 NoV，在消化道中未檢出GII.4 NoV；在10 ℃時，GII.4 NoV在海水、牡蠣鰓、消化道和外套膜中均有檢出；15、20、25 ℃時，GII.4 NoV主要分布在牡蠣消化道、鰓和外套膜中；在30 ℃時牡蠣代謝緩慢，GII.4 NoV主要分布在海水、牡蠣鰓和外套膜中，在牡蠣消化道中未檢出。不同溫度下GII.4 NoV檢出量不同，可能是牡蠣的代謝活力不同造成的，牡蠣在最適溫度15～25 ℃時代謝旺盛，適宜的溫度可以加快病毒在牡蠣體內(nèi)的積累。

2.4 不同鹽度條件下NoVs在牡蠣組織中含量的變化

圖2 不同鹽度下GII.4 NoV在牡蠣組織中的含量Fig.2 Contents of GII.4 NoV in oyster tissues at different salinities

從圖2中可以看出，鹽度為10‰時，在海水和牡蠣消化道、鰓及外套膜中均能檢測出GII.4 NoV；鹽度為20‰、30‰時，海水中檢測不到GII.4 NoV，牡蠣消化道、鰓和外套膜中均能檢測到GII.4 NoV，但其主要存在于消化道中；鹽度為40‰時牡蠣代謝緩慢，GII.4 NoV主要存在于海水中，牡蠣組織中未檢測到GII.4 NoV。這說明適宜的鹽度能加快NoVs在牡蠣體內(nèi)的積累。

2.5 不同時間NoVs在牡蠣組織中含量的變化

圖3 GII.4 NoV在牡蠣組織中的遷移分布變化Fig.3 Contents and distribution of GII.4 NoV in oyster tissues

從圖3中可以看出，由于牡蠣的濾食作用，海水中的GII.4 NoV不斷減少，6 h后海水中檢測不到GII.4 NoV。牡蠣外套膜中的GII.4 NoV含量比較穩(wěn)定，在6 h時含量為（8.75±0.36）×104拷貝數(shù)，24 h時含量為（9.12±0.49）×104拷貝數(shù)，且無顯著性差異（P＞0.05）。牡蠣鰓中的GII.4 NoV含量先增大后降低，6 h時最高，為（1.15±0.15）×106拷貝數(shù)，24 h時為（2.51±0.07）×105拷貝數(shù)，這可能是由于濾食作用使GII.4 NoV不斷經(jīng)過鰓，最終進(jìn)入消化道的原因造成的。消化道中的GII.4 NoV含量不斷增加并趨于穩(wěn)定，12h時含量為（1.06±0.14）×106拷貝數(shù)，24 h時為（1.21±0.23）×106拷貝數(shù)，且無顯著差異（P＞0.05）。牡蠣各組織從12 h開始GII.4 NoV含量趨于穩(wěn)定，并且海水中檢測不到GII.4 NoV，說明牡蠣養(yǎng)殖24 h后可以將實(shí)驗(yàn)濃度下的GII.4 NoV完全富集。

2.6 凈化對牡蠣中NoVs含量的影響分析

圖4 不同凈化時間下牡蠣組織中GII.4 NoV的含量Fig.4 Contents of GII.4 NoV in oyster tissues after purification

從圖4中可以看出，凈化6、12、24 h之后的牡蠣組織GII.4 NoV含量變化不大，凈化24 h時牡蠣消化道中GII.4 NoV含量為（1.26±0.21）×106拷貝數(shù)，鰓中GII.4 NoV含量為（2.90±0.13）×105拷貝數(shù)，外套膜中GII.4 NoV含量為（9.52±0.34）×104拷貝數(shù)，海水中未檢出GII.4 NoV。經(jīng)過凈化之后，牡蠣各組織中GII.4 NoV含量與凈化前相比差異不顯著（P＞0.05），說明病毒在牡蠣組織內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.7 牡蠣組織中NoVs的分布特性

圖5 不同時間牡蠣組織中GII.4 NoV的分布Fig.5 Distribution of GII.4 NoV in various oyster tissues as a function of time

從圖5中可以看出，隨著凈化時間的延長，牡蠣外套膜中的GII.4 NoV主要集中在膜邊緣，并且顏色較淺（+），含量比較穩(wěn)定，這與實(shí)時熒光定量RT-PCR結(jié)果中外套膜中病毒含量較低且穩(wěn)定的結(jié)果一致。牡蠣鰓中的GII.4 NoV主要集中在鰓壁上，顏色先加深（+++）后變淺（+）并趨于穩(wěn)定（+），與實(shí)時熒光定量RT-PCR結(jié)果一致。牡蠣消化道中的GII.4 NoV主要分布在消化道內(nèi)壁上，顏色逐漸加深，6、12、24 h顏色均較深（+++）。從免疫組織化學(xué)切片陽性強(qiáng)度的顏色看，牡蠣組織中GII.4 NoV積累規(guī)律與實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測的定量結(jié)果基本一致。

3 討 論

由于牡蠣是濾食性動物，短時間內(nèi)可以過濾大量海水[19]，水中污染的NoVs會隨濾食過程進(jìn)入牡蠣體內(nèi)，但不會通過代謝排出體外，從而蓄積在其體內(nèi)，即使經(jīng)過凈化也很難把NoVs排出[20]。本研究對比了4 種GII.4 NoV濃度，發(fā)現(xiàn)高濃度的病毒在24 h內(nèi)并不能完全被牡蠣過濾，而過低濃度的GII.4 NoV由于回收率低，難以準(zhǔn)確定量，因此研究選擇了稀釋100 倍的病毒液污染牡蠣。在流行病學(xué)調(diào)查中，冬、春季節(jié)是人類感染NoVs高發(fā)期[21-23]，但在貝類中檢測出NoVs的季節(jié)性并不一致[24]。例如青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室對2009年12月—2011年11月的840 個貝類樣品的檢測結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，牡蠣中的NoVs在春、夏、秋、冬均能檢出[25]。Schaeffer等[26]研究了法國市場上收集16 個月的牡蠣，發(fā)現(xiàn)9%的樣本受到季節(jié)性和氣候的影響而存在NoVs。本研究檢測了6 個溫度條件下牡蠣中GII.4 NoV的變化，發(fā)現(xiàn)溫度影響了牡蠣的活力，從而導(dǎo)致了GII.4 NoV在牡蠣不同組織中的含量差異，這說明適宜的溫度加快了GII.4 NoV在牡蠣組織中的積累，但是溫度是否影響到NoVs與牡蠣的緊密結(jié)合還有待于進(jìn)一步研究。本研究同時分析了不同鹽度對牡蠣中GII.4 NoV積累的影響，結(jié)果表明適宜的鹽度有利于牡蠣代謝，加快了GII.4 NoV在牡蠣中的積累。

關(guān)于牡蠣中NoVs的分布報道并不一致：Le Guyader等的研究發(fā)現(xiàn)GII型NoV分布在牡蠣的外套膜和鰓中[27]；McLeod等的研究發(fā)現(xiàn)NoVs主要存在于牡蠣消化道部位[28]；GII型NoV在泰國曼谷牡蠣的所有部位中均有檢出，但不是同一個牡蠣的多個部位，GII.4 NoV分布在牡蠣鰓和外套膜中，GII.7 NoV分布在牡蠣消化道中，GII.21 NoV分布在牡蠣外套膜中[15]。由于在牡蠣生長過程中，NoVs進(jìn)入其體內(nèi)可能受到病毒的基因型、海水溫度、鹽度、光照、風(fēng)向、樣品數(shù)量、代表性等因素制約，而這些條件往往是難以確定和把控的；因此采樣檢測并未獲得明確的積累和分布規(guī)律。本研究采用實(shí)驗(yàn)室人工控制條件，通過定向污染GII.4 NoV進(jìn)行牡蠣養(yǎng)殖，采用實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測不同時間、不同牡蠣組織中GII.4 NoV的含量，采用免疫組織化學(xué)切片定位不同時間、不同牡蠣組織中GII.4 NoV的分布，分析GII.4 NoV在牡蠣體內(nèi)的含量變化和分布特征。實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨時間的延長，GII.4 NoV在牡蠣組織中的分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律，牡蠣外套膜中檢測出的GII.4 NoV含量比較穩(wěn)定，鰓中的GII.4 NoV含量先增加后減少，消化道中的GII.4 NoV含量不斷增加，在12 h后各組織中GII.4 NoV分布均趨于穩(wěn)定，這與牡蠣的濾食代謝相符，即NoVs經(jīng)過濾食過程經(jīng)過外套膜，從鰓過濾后進(jìn)入消化道，這與McLeod等[28]的結(jié)果一致。經(jīng)過一定時間的凈化，GII.4 NoV在牡蠣組織中的分布與凈化前相比未發(fā)生明顯變化，這與貝類病毒難以凈化的報道一致[11]。免疫組織化學(xué)切片結(jié)果中不同牡蠣組織出現(xiàn)的陽性結(jié)果及其顏色深度也證實(shí)了實(shí)時熒光定量RT-PCR結(jié)果。近年來，在亞洲還出現(xiàn)了GII.17 NoV等變異毒株[29-30]，但由于陽性病毒和免疫組織化學(xué)抗體的缺乏，本研究只分析了GII.4 NoV，其他毒株是否在牡蠣中也存在特定的分布規(guī)律有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究在實(shí)驗(yàn)室控制環(huán)境條件下，人工污染GII.4 NoV養(yǎng)殖太平洋牡蠣，以探討NoVs在太平洋牡蠣組織中的含量變化和分布特性。實(shí)時熒光定量RT-PCR結(jié)果表明：GII.4 NoVs在牡蠣外套膜中的含量比較穩(wěn)定，在（8.75±0.36）×104～（9.12±0.49）×104拷貝數(shù)之間；在牡蠣鰓中的含量先增加后減少，6 h時達(dá)到最高（（1.15±0.15）×106拷貝數(shù)）；在牡蠣消化道中含量逐漸增加，12 h時達(dá)（1.06±0.14）×106拷貝數(shù)并趨于穩(wěn)定；24 h后主要分布于牡蠣的消化道組織中，凈化對牡蠣體內(nèi)富集的GII.4 NoV含量無顯著影響。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，GII.4 NoV廣泛分布在牡蠣外套膜邊緣、鰓壁和消化道內(nèi)壁上，其分布隨時間變化趨勢與實(shí)時熒光定量RT-PCR結(jié)果一致。本研究為進(jìn)一步研究NoVs在牡蠣中的生物積累規(guī)律、特異性結(jié)合機(jī)制，從而開展牡蠣中NoVs預(yù)警監(jiān)測和制定貝類凈化方案提供參考。