王 莉，陳良強(qiáng)，楊 帆，陳宗校，王和玉

（貴州茅臺(tái)酒股份有限公司 技術(shù)中心，貴州 仁懷 564500）

酵母菌是白酒釀造過程中重要的一類微生物，不僅是推動(dòng)發(fā)酵進(jìn)程的主導(dǎo)力量之一，同時(shí)代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味化合物也是影響白酒風(fēng)格和品質(zhì)的重要因素[1-4]。在醬香型白酒釀造過程中，酵母菌經(jīng)堆積發(fā)酵過程得到大量的富集與繁殖，然后進(jìn)入窖內(nèi)參與厭氧發(fā)酵過程[5-6]。

由于醬香型白酒釀造工藝輪次多、周期長(zhǎng)，在窖內(nèi)厭氧發(fā)酵過程中，乳酸菌等產(chǎn)酸微生物代謝產(chǎn)生大量的酸類物質(zhì)，使酒醅中難揮發(fā)性酸類物質(zhì)不斷積累。乳酸作為酒醅中主要的酸類物質(zhì)，在中后期輪次酒醅中乳酸含量達(dá)到20～40 g/kg酒醅[7]。一般情況下，過高的乳酸會(huì)使微生物細(xì)胞內(nèi)外質(zhì)子和陰離子對(duì)細(xì)胞膜、核糖體核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、活性酶類產(chǎn)生破壞作用，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)和代謝過程[8-9]。但長(zhǎng)期處于醬香型白酒這樣酸性釀造環(huán)境的脅迫和馴化下，一些釀造微生物已經(jīng)具有較強(qiáng)的抗逆特性，從而保障了后期輪次發(fā)酵的正常進(jìn)行[10-12]。文獻(xiàn)報(bào)道傳統(tǒng)發(fā)酵食品中部分酵母菌對(duì)弱酸具有較強(qiáng)的耐受性，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可在1%的乙酸條件下生長(zhǎng)[13-14]，拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）對(duì)乙酸、乳酸、山梨酸等都具有較高的耐受性[15-16]，然而對(duì)醬香型白酒釀造過程中耐乳酸酵母的種類及特性的相關(guān)研究還較少。

本研究以醬香型白酒發(fā)酵酒醅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，篩選一株具有高乳酸耐受性的酵母菌，并比較該菌株與模式菌株ATCC6258及用于白酒釀造菌株CICC1926對(duì)乳酸和乙酸的耐受特性。最后，初步解析該菌株在不同乳酸含量條件下產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的代謝特征。該研究不僅有助于加深對(duì)醬香型白酒釀造機(jī)制的認(rèn)識(shí)和理解，同時(shí)也為耐酸酵母的篩選提供了較好的參考價(jià)值，為酵母高乳酸耐受性機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬香型白酒發(fā)酵酒醅：貴州茅臺(tái)酒股份有限公司制酒車間。

1.1.2 菌株

庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母模式菌株ATCC6258、用于白酒釀造庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母CICC1926：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ChinaCenterofIndustrialCultureCollection，CICC）。

1.1.3 主要試劑

酵母基因組提取試劑盒：日本TaKaRa公司；其他所需試劑均為分析純，均購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：乳酸40 g/L，葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10g/L，磷酸氫二鉀2g/L，氯化鈉1g/L，硫酸鎂0.1g/L，硫酸錳0.05 g/L。

篩選培養(yǎng)基：乳酸40 g/L，葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液態(tài)培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L。YPD液態(tài)培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L即為YPD固態(tài)培養(yǎng)基。

含5%葡萄糖YPD液態(tài)培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L。

上述培養(yǎng)基pH自然，115℃滅菌15～20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司；CX23光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；c1000觸摸屏（雙模塊）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 耐乳酸特性菌株的篩選

稱取樣品10g于90mL帶玻璃珠的無菌水中，振蕩均勻，吸取0.1 mL上清液于100 mL富集培養(yǎng)基中，分別在有氧/無氧、30℃/37℃條件下靜置培養(yǎng)2～4 d，觀察培養(yǎng)液是否渾濁；若培養(yǎng)液已明顯渾濁時(shí)，吸取0.1 mL富集培養(yǎng)液于新的100mL液態(tài)篩選培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)3～4次后將培養(yǎng)液梯度稀釋于YPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～4 d后，其單菌落即為抗乳酸特性的目標(biāo)菌株。

1.3.2 菌株的鑒定

菌株形態(tài)觀察：將篩選得到的耐乳酸特性菌株接種于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落形態(tài)；同時(shí)在顯微鏡下觀察菌種細(xì)胞形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：采用試劑盒法提取基因組[17]，以其為模板對(duì)目標(biāo)菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測(cè)序引物為NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：Taq-Mix酶12 μL，引物NL1和引物NL4各1 μL，模板1 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)合格后送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將26SrDNAD1/D2區(qū)測(cè)序結(jié)果上傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology infor mation，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載同源性高的菌株的基因序列，采用Clustal X進(jìn)行序列比對(duì)分析，再利用MEGA6.0軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

種子液制備方法：利用YPD固態(tài)培養(yǎng)基對(duì)各酵母菌株進(jìn)行劃線活化，30℃培養(yǎng)2 d，然后利用接種環(huán)挑選平板上單菌落接種于裝液量為50 mL/250 mL的YPD液態(tài)培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12 h。

將目標(biāo)菌株、模式菌株ATCC6258和用于白酒釀造庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母CICC1926的種子液分別接入含有5%葡萄糖的YPD液體培養(yǎng)基中，接種后液體培養(yǎng)基中初始細(xì)胞數(shù)量約為106CFU/mL，30℃靜置培養(yǎng)，每隔8 h取樣測(cè)定其OD600nm值。

1.3.4 菌株耐受性研究

乳酸耐受性：將目標(biāo)菌株MT-Y01、菌株ATCC6258和CICC1926的種子液分別接種于含不同質(zhì)量濃度乳酸（0、40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120 g/L）的YPD液體培養(yǎng)基中，接種后液體培養(yǎng)基中初始細(xì)胞數(shù)量約為106CFU/mL，30℃靜置培養(yǎng)4 d后測(cè)定其OD600nm值。

乙酸耐受性：將目標(biāo)菌株MT-Y01、菌株ATCC6258和CICC1926的種子液分別接種于含不同質(zhì)量濃度乙酸（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）的YPD液體培養(yǎng)基中，接種后液體培養(yǎng)基中初始細(xì)胞數(shù)量約為106CFU/mL，30℃靜置培養(yǎng)4 d后測(cè)定其OD600nm值。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

將目標(biāo)菌株的種子液接種于含有5%葡萄糖的YPD液體培養(yǎng)基中，接種后液體培養(yǎng)基中初始細(xì)胞數(shù)量約為106CFU/mL，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的乳酸（0、20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120 g/L），30 ℃靜置發(fā)酵4 d。

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液8 000×g離心10 min，取上清液10 mL裝于頂空進(jìn)樣瓶中，并加入3 g氯化鈉。通過頂空固相微萃取技術(shù)（head-space solid phase microextraction，HS-SPME）進(jìn)行萃取，再利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進(jìn)樣分析。氣相色譜分離條件：柱溫初始溫度為60℃，以6℃/min的升溫速率升至230℃，保持15min；柱流量1.6mL/min，采用恒壓模式；進(jìn)樣口溫度230℃。質(zhì)譜條件：電子電離電壓為70 eV；四極桿溫度150℃；離子源溫度230℃；采用全掃描方式（scan），使用35～550 amu的質(zhì)量范圍，溶劑延遲5 min。將未知物質(zhì)圖譜與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NationalInstitute ofStandardsandTechnology，NIST）08a.L Datebase中標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行定性分析。采用面積歸一法確定相對(duì)含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

將得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰面積進(jìn)行歸一化處理后，然后利用R語(yǔ)言的pheatmap程序包進(jìn)行熱圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選分離與鑒定

為模擬發(fā)酵實(shí)際環(huán)境，將酒醅樣品稀釋后直接接入液態(tài)富集培養(yǎng)基，然后置于不同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，觀察發(fā)酵液是否渾濁，從而判斷是否有菌株生長(zhǎng)，結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)條件下菌株的生長(zhǎng)情況Table 1 Growth situation of strains under different culture conditions

由表1可知，酒醅樣品在含有40 g/L的乳酸液態(tài)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，其中有氧條件下生長(zhǎng)最為旺盛。初步表明酒醅中存在耐乳酸特性的菌株。為進(jìn)一步確認(rèn)，對(duì)30℃有氧條件下培養(yǎng)的發(fā)酵液進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，以確定其微生物具有穩(wěn)定的乳酸耐受能力。傳代富集培養(yǎng)3～4代后，對(duì)富集培養(yǎng)液稀釋涂布，分離得到單菌落，其菌落及細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見圖1。

圖1 酒醅樣品中菌株在YPD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（a）與細(xì)胞形態(tài)（b）Fig.1 Colonial morphology(a)and cell morphology(b)of strain from fermented grains samples on the YPD medium

通過多次的富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的微生物種類大大減少，由圖1可知，所有菌落形態(tài)一致，菌落呈白色，表面粗糙，質(zhì)地均勻，易挑取。通過顯微鏡觀察形態(tài)結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離篩選得到的菌種細(xì)胞呈橢圓狀，部分正在出芽分裂。因此，初步確定分離得到的菌株為酵母菌。

從該平板中隨機(jī)挑選7個(gè)單菌落，菌株編號(hào)分別為MTY01～MT-Y07。7株菌株的測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該7株菌均與庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）NRRL Y-5396的26S rDNA基因序列相似度為99%。選取同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 7株菌株基于26S rDNA D1/D2區(qū)域序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 7 strains based on 26S rDNA D1/D2 sequences analysis

由圖2可知，7株酵母菌與庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）NRRL Y-5396聚于一支，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，確定7株酵母菌均為庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。因此，挑選編號(hào)為MT-Y01的酵母菌作為代表菌株進(jìn)行研究。菌株MT-Y01現(xiàn)已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC），編號(hào)為CGMCC 14068。

2.2 菌株MT-Y01的菌落形態(tài)

為研究不同環(huán)境對(duì)庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母形態(tài)特性的影響，對(duì)菌株MT-Y01、ATCC6258和CICC1926的菌落形態(tài)進(jìn)行對(duì)比，菌落形態(tài)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，3株菌株雖然都屬于同一種酵母，但形態(tài)差別明顯。其中菌株MT-Y01和CICC1926的菌落均為白色、圓形，表面呈粉狀，但菌株MT-Y01的菌落周圍有圓環(huán)。來源于人的口腔中模式菌株ATCC6258的菌落形態(tài)與其他兩株差異較大，分析原因可能是由于環(huán)境不同造成的，菌株MT-Y01和CICC1926都來源于白酒釀造過程，因此兩者菌落形態(tài)較為相似，但由于不同香型白酒釀造工藝、環(huán)境的不同，從而也造成這兩株菌之間的菌落形態(tài)仍有一定的差別。

圖3 菌株MT-Y01（a）、ATCC6258（b）、CICC1926（c）在YPD培養(yǎng)基的菌落形態(tài)特征Fig.3 Colonial morphological characteristics of strain MT-Y01(a),ATCC6258(b)and CICC1926(c)on the YPD medium

2.3 菌株MT-Y01的生長(zhǎng)特性

分別將3株酵母接入含有5%葡萄糖的YPD液態(tài)培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)，測(cè)得不同時(shí)間發(fā)酵液中菌體濃度，繪制其生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 菌株MT-Y01、ATCC6258和CICC1926在含有5%葡萄糖YPD液態(tài)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of strain MT-Y01,ATCC6258 and CICC1926 in YPD liquid medium containing glucose 5%

由圖4可知，菌株MT-Y01生長(zhǎng)速率最快，模式菌株ATCC6258生長(zhǎng)慢，且菌體濃度最高OD600nm值＜26；而來源于白酒釀造過程中的CICC1926生長(zhǎng)速率和菌體濃度略低于菌株MT-Y01。結(jié)果表明，在白酒釀造環(huán)境過程中馴化的菌株生長(zhǎng)速率更快，特別是在醬香型白酒釀造過程中高溫高酸等環(huán)境脅迫條件下，菌株具有更好的適應(yīng)性和繁殖能力。

2.4 菌株MT-Y01的酸耐受性分析

2.4.1 乳酸耐受性能研究

將菌株MT-Y01和ATCC6258、CICC1926分別接入含有不同質(zhì)量濃度乳酸的YPD液態(tài)培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)4d，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定培養(yǎng)液中菌株的OD600nm值，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，3株酵母菌都具有較強(qiáng)的乳酸耐受特性，且當(dāng)乳酸含量為40 g/L時(shí)，菌體的OD600nm值最高，在35.0～36.3之間，表明該種類的酵母菌均具有一定的乳酸耐受性。但菌株MT-Y01有極強(qiáng)的乳酸耐受性能，在乳酸含量為100～120 g/L的條件下仍可生長(zhǎng)，而其他兩株菌在乳酸含量為60g/L條件下生長(zhǎng)非常緩慢，在80g/L的條件下已不能生長(zhǎng)。

圖5 不同乳酸含量下酵母菌株的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth situation of yeasts with different lactic acid contents

2.4.2 乙酸耐受性能研究

將菌株MT-Y01和ATCC6258、CICC1926分別接入含有不同質(zhì)量濃度乙酸的液態(tài)培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定培養(yǎng)液中菌株OD600nm值，結(jié)果見圖6。

圖6 不同乙酸含量下酵母菌株的生長(zhǎng)情況Fig.6 Growth situation of yeasts with different acetic acid contents

由圖6可知，3株酵母菌對(duì)乙酸的耐受性較弱，當(dāng)乙酸含量＞30g/L之后，所有菌株都不能生長(zhǎng)，但與菌株ATCC6258和CICC1926相比，菌株MT-Y01在乙酸含量為20 g/L的條件下仍有一定的生長(zhǎng)。

醬香型白酒獨(dú)特的發(fā)酵環(huán)境長(zhǎng)期對(duì)釀酒微生物進(jìn)行馴化，促成了釀酒微生態(tài)環(huán)境中豐富的抗高溫、抗高酸和抗高乙醇等特性的極端微生物的富集。與模式菌株ATCC6258和來源于其他白酒釀造環(huán)境的CICC1926相比，菌株MT-Y01在生長(zhǎng)速率、乳酸耐受性及其乙酸耐受性方面都具有更強(qiáng)的特性。

2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

菌株MT-Y01在不同質(zhì)量濃度的乳酸條件進(jìn)行發(fā)酵，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析結(jié)果見圖7。從2.4.1節(jié)可知，菌株MT-Y01在不同乳酸質(zhì)量濃度條件下生長(zhǎng)有所差異，同樣其代謝活動(dòng)和代謝產(chǎn)物也可能發(fā)生改變。同時(shí)在醬香型白酒制酒過程中，其酒醅中的乳酸含量也在不斷發(fā)生變化，下沙堆積時(shí)，酒醅中乳酸含量＜10g/kg酒醅，中后期則升高至40g/kg酒醅。因此，對(duì)菌株MT-Y01在不同乳酸質(zhì)量濃度條件下的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖7。

圖7 菌株MT-Y01在不同乳酸含量下所產(chǎn)風(fēng)味化合物的變化熱圖Fig.7 Heat map of flavor compounds changes produced by strain MT-Y01 with different lactic acid contents

由圖7可知，菌株MT-Y01在不同的乳酸含量條件下主要代謝產(chǎn)生了15種揮發(fā)性化合物，這些物質(zhì)都是醬香型白酒中重要的風(fēng)味化合物，包括4種酸類、3種醇類和8種酯類。其中酯類物質(zhì)的種類和含量分別占全部風(fēng)味物質(zhì)種類和含量的50%以上，這表明該酵母菌酯類物質(zhì)代謝生成能力強(qiáng)，是一株醬香型白酒釀造過程中重要的產(chǎn)酯酵母菌。不同乳酸含量條件下，菌株MT-Y01代謝能力差別明顯，當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，其產(chǎn)酯能力最強(qiáng)；當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度為120 g/L時(shí)，菌株MT-Y01的產(chǎn)酯能力受到嚴(yán)重抑制。表明該菌株可在0～100 g/L的乳酸含量條件下產(chǎn)酯，但不同酯類物質(zhì)在不同乳酸含量條件下產(chǎn)量差異大，如乙酸乙酯在乳酸含量為40 g/L時(shí)產(chǎn)量最高，占總風(fēng)味物質(zhì)峰面積的47.1%，丙酸乙酯在乳酸含量為80 g/L時(shí)產(chǎn)量最高，占總風(fēng)味物質(zhì)峰面積的4.3%，而辛酸乙酯在不含乳酸時(shí)產(chǎn)量最高，占總風(fēng)味物質(zhì)峰面積的1.9%。

3 結(jié)論

醬香型白酒釀造工藝獨(dú)特，是在高溫、高酸等極端環(huán)境條件下進(jìn)行發(fā)酵。本研究利用多次傳代篩選的方式，從醬香型白酒酒醅中分離得到了一株高乳酸耐受性的庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），該菌株有一定乙酸耐受性，最高可耐受120 g/L的乳酸。菌株在0～120 g/L的乳酸含量條件下，可代謝重要的風(fēng)味物質(zhì)，當(dāng)乳酸含量為40 g/L時(shí)，其產(chǎn)酯種類多、能力強(qiáng)，特別是乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯含量高，該結(jié)果表明此菌株是一株乳酸耐受能力強(qiáng)的產(chǎn)酯酵母菌，是醬香型白酒釀造過程中重要的功能菌之一。