張業(yè)芳，唐 詩，周 艷*，楊 娜，張清海

（貴州醫(yī)科大學(xué) 食品安全學(xué)院，貴州 貴陽 550000）

獼猴桃（Actinidia）屬于獼猴桃科獼猴桃屬漿果類藤本植物，又名奇異果、楊桃、基維果。其果汁多肉厚，質(zhì)地柔軟，含有豐富的糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、多酚、黃酮類化合物[1]。研究表明，獼猴桃具有潤腸通便[2]、抑制癌細(xì)胞增殖[3-4]、調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化[5]等生理功能。因此，獼猴桃成為了消費(fèi)者日常食用較多的水果之一。近年，我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已經(jīng)成為了世界上獼猴桃種植面積和產(chǎn)量最大的國家，在陜西、四川、貴州、浙江等地形成了一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模。

獼猴桃屬于典型的呼吸躍變型水果，采摘后容易變軟，甚至失去食用價(jià)值，每年由此而造成的損失高達(dá)25%[6]。因此，深入研究獼猴桃的營養(yǎng)、保健價(jià)值，開發(fā)獼猴桃系列健康食品是促進(jìn)我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)可持續(xù)、健康發(fā)展的必由途徑。益生菌發(fā)酵果蔬類制品由于能改善新鮮蔬菜的感官特性，并提高果蔬的營養(yǎng)價(jià)值，以及良好的健康促進(jìn)作用[7-8]，引起了學(xué)術(shù)界和市場的強(qiáng)烈關(guān)注。研究表明，乳酸菌發(fā)酵提供的酸性環(huán)境，可以保護(hù)維生素不被氧化[9]；同時(shí)乳酸菌影響果蔬多酚的組成，進(jìn)而影響果蔬的抗氧化能力[10-11]。DI C R等[12]發(fā)現(xiàn)，通過植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵的番茄汁在保藏過程中能維持抗壞血酸含量在120～140mg/L，而直接保藏的番茄汁其含量下降至60～90mg/L；XIAO Y等[13]研究顯示，相比于未發(fā)酵的大豆乳清，植物乳桿菌B1-6發(fā)酵大豆乳清能提高其總酚酸和異黃酮苷元的含量，提高自由基清除能力，降低脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的氧化損傷；BISAKOWSKI B等[14]利用植物乳桿菌S1對(duì)紅洋蔥發(fā)酵72 h，促使槲皮素二糖苷向抗氧化活性更強(qiáng)的槲皮單糖苷的轉(zhuǎn)化。然而，益生菌發(fā)酵對(duì)果蔬抗氧化活性變化的機(jī)制并不清楚。

因此，本研究以貴州優(yōu)勢(shì)獼猴桃品種——“貴長”為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室前期研究得到的植物乳桿菌發(fā)酵獼猴桃果漿的最適發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，分析獼猴桃果漿在發(fā)酵過程中總酚酸、總黃酮及維生素C（vitamin C，VC）含量和抗氧化活性的變化，分析抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性的相關(guān)性，并采用液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS）儀測定酚酸和黃酮的組成，探討植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)獼猴桃果漿抗氧化活性影響的因素，同時(shí)可以為獼猴桃乳酸菌發(fā)酵飲料生理功能的進(jìn)一步探討提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌凍干粉：山東中科嘉億生物工程有限公司。

1.1.2 試劑

草酸、碳酸氫鈉、碳酸鈉、無水乙醇、甲酸（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2,6-二氯靛酚鈉鹽、福林酚試劑、1,1-二苯肼-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：北京索萊寶科技有限公司；2,2′-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）（純度≥98%）、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、甲醇（色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LT1002C型電子天平：常熟市天量儀器有限責(zé)任公司；721型可見分光光度計(jì)：上海菁華科機(jī)儀器有限公司；Waters Xevo TQ-S Micro三重四極桿LC-MS儀：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵獼猴桃果漿的制備

按照文獻(xiàn)[15]中植物乳桿菌發(fā)酵獼猴桃果漿的最佳工藝條件制備獼猴桃果漿，測定其理化指標(biāo)（乳酸菌活菌數(shù)、總酸含量、pH值）、抗氧化物質(zhì)（維生素C、總酚酸、總黃酮）含量及其抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力）、酚酸和黃酮的組成。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

乳酸菌活菌數(shù)的測定：參照國標(biāo)GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行測定[16]。

總酸含量的測定：參照國標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法檢測總酸含量[17]。

pH的測定：采用pH計(jì)測定獼猴桃果漿的pH值。

1.3.3 抗氧化物質(zhì)含量的測定

VC含量的測定：參照國標(biāo)GB/T 5009.86—2016《食品中抗壞血酸的測定》，采用2,6-二氯靛酚法檢測VC的含量[18]。

總酚酸含量的測定：取10 mL發(fā)酵后的獼猴桃果漿樣品，加入30 mL體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇，在60℃、450 W條件下超聲20 min，離心取上清，待測。采用福林酚法檢測樣品中總酚酸的含量[19]。以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.009 0x+0.103 5，R2=0.999 4。

總黃酮含量的測定：采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定樣品中總黃酮的含量[20]。以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)測繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.001 6x+0.005 5，R2=0.999 2。

1.3.4 抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參考文獻(xiàn)[19]，并稍作修改：取一定量的各處理獼猴桃果漿于4500r/min條件下離心10 min，取上清待測。吸取各待測樣本45 μL，加入5 mL DPPH溶液，漩渦振蕩混勻，37℃條件下避光水浴30 min，在波長517 nm處測定吸光度值，記為A1，同時(shí)以45 μL蒸餾水替代樣品作對(duì)照，其所測得的吸光度值為A2。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

ABTS自由基清除能力的測定參考文獻(xiàn)[19]，并稍作修改：取一定量的各處理獼猴桃果漿于4 500 r/min條件下離心10min，取上清待測。吸取各待測樣本50μL，加入5mL ABTS溶液，漩渦振蕩混勻，37℃條件下避光水浴30 min，在波長746 nm處測定吸光度值，記為A1，同時(shí)以50 μL蒸餾水替代樣品作對(duì)照，其所測得的吸光度值為A2。ABTS自由基清除率的計(jì)算公式如下：

1.3.5 多酚組成的測定

分別取發(fā)酵前、后的獼猴桃果漿樣品的提取液，經(jīng)過0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾后備用。采用LC-MS法測定樣品中的酚酸和黃酮的組成[21]。

液相色譜條件：色譜柱為WatersACQUITYUPLCBEH C18（2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相A為0.25%甲酸水溶液；流動(dòng)相B為0.25%甲酸-甲醇溶液；流速為0.3 μL/mL；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為35℃；光電二極管陣列（photo-diode array，PDA）檢測，200～500 nm連續(xù)掃描。梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜檢測條件：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，噴霧電壓2.0 kV，錐孔電壓30 V，脫溶劑溫度400℃，脫溶劑氣（N2）1 000 L/h。質(zhì)譜掃描條件：電噴霧電離（electronic spray ionization，ESI）正離子模式（噴霧電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，脫溶劑溫度400℃，脫溶劑氣（N2）1 000 L/h，掃描范圍100～2 000 m/z）；ESI負(fù)離子模式（噴霧電壓0.5 kV，錐孔電壓30 V，脫溶劑溫度400℃，脫溶劑氣（N2）1 000 L/h，掃描范圍100～2 000 m/z）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量，其結(jié)果用相對(duì)含量（%）表示。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（xˉ±s）表示。采用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)多重比較采用Turkey法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Person進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果漿發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

獼猴桃果漿經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)、總酸含量和pH值的變化如圖1所示。

由圖1A可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，獼猴桃果漿中植物乳桿菌的含量呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)，與發(fā)酵0 h相比，發(fā)酵7 h時(shí)，植物乳桿菌的活菌數(shù)（5.82 lgCFU/g）顯著降低（P＜0.05），隨后逐漸升高；發(fā)酵28 h時(shí)，植物乳桿菌的活菌數(shù)為9.95 lgCFU/g。由圖1B可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，獼猴桃果漿中總酸的含量逐漸升高，與發(fā)酵0 h相比，發(fā)酵14 h時(shí)，總酸含量顯著升高（P＜0.05），為7.97 g/kg；發(fā)酵28 h時(shí)，總酸含量達(dá)到16.18 g/kg。由圖1C可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，獼猴桃果漿的pH值逐漸降低，發(fā)酵14 h后，pH值與初始發(fā)酵時(shí)的pH值呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；發(fā)酵28 h時(shí)pH值為4.43。發(fā)酵初期，植物乳桿菌的含量降低，可能是對(duì)發(fā)酵體系不適應(yīng)，經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)后，植物乳桿菌利用體系中營養(yǎng)物質(zhì)（碳水化合物、蛋白質(zhì)等）快速增殖，產(chǎn)生乳酸等小分子有機(jī)酸，從而使總酸的含量升高、pH值下降。

圖1 發(fā)酵過程中獼猴桃果漿中植物乳桿菌數(shù)（A）、總酸含量（B）和pH值（C）的變化Fig.1 Changes of Lactobacillus plantarumcount(A),total acid content(B)and pH value(C)in kiwifruit pulp during fermentation process

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)獼猴桃果漿中抗氧化物質(zhì)含量的影響

植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)獼猴桃果漿中抗氧化物質(zhì)含量的影響結(jié)果見圖2。

由圖2A可知，與發(fā)酵前獼猴桃果漿中的總酚酸含量（103.16mg/100g）相比，發(fā)酵14h時(shí)，獼猴桃果漿中的總酚酸含量（108.55 mg/100 g）無顯著提高（P＞0.05）；發(fā)酵21 h時(shí)，總酚酸含量（150.73mg/100g）顯著提高（P＜0.05）；發(fā)酵28 h時(shí)，總酚酸含量上升至168.04mg/100g，較發(fā)酵前提高62.89%。

由圖2B可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，獼猴桃果漿中總黃酮的含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。與發(fā)酵前（21.75mg/100 g）相比，發(fā)酵7 h時(shí)，總黃酮含量（34.50 mg/100 g）顯著升高（P＜0.05）；到發(fā)酵21 h時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高，為42.55 mg/100 g；發(fā)酵21 h后，總黃酮的含量開始降低；發(fā)酵28 h時(shí)，總黃酮的含量為36.75 mg/100 g，但仍顯著高于發(fā)酵前（P＜0.05），較發(fā)酵前提高68.97%。結(jié)果表明，植物乳桿菌發(fā)酵有利于提高獼猴桃果漿中總酚酸和總黃酮的含量，與SZWAJGIER D等[22-23]的研究結(jié)果一致。

由圖2C可知，發(fā)酵過程中獼猴桃果漿中VC的含量比較穩(wěn)定，在發(fā)酵過程中無顯著差異性（P＞0.05）。分析原因可能是乳酸菌代謝產(chǎn)生大量乳酸，降低體系pH值，形成了一個(gè)酸性環(huán)境，使VC含量相對(duì)穩(wěn)定[9，12]。

圖2 發(fā)酵過程中獼猴桃果漿中總酚酸（A）、總黃酮（B）及VC（C）含量的變化Fig.2 Changes of the contents of total phenolic acid(A),total flavonoids(B)and VC(C)in kiwifruit pulp during fermentation process

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)獼猴桃果漿抗氧化能力的影響

乳酸菌發(fā)酵果蔬對(duì)果蔬抗氧化能力的影響比較復(fù)雜。PIANPUMEPONG P等[24]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵能增強(qiáng)姜黃的鐵離子還原能力，同時(shí)降低小鼠血液中自由基數(shù)量；DI C R等[25]應(yīng)用戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SWE5和植物乳桿菌FP3混合發(fā)酵甜櫻桃果泥，提高了其抗氧化能力；同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道[26-27]，乳酸菌發(fā)酵能降低果蔬對(duì)自由基的清除能力。植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)獼猴桃果漿抗氧化能力的影響結(jié)果見圖3。

由圖3A可知，與發(fā)酵前獼猴桃果漿的DPPH自由基清除率（46.79%）相比，發(fā)酵7 h時(shí)，植物乳桿菌對(duì)獼猴桃果漿的DPPH自由基清除率（46.33%）無顯著影響（P＞0.05）；發(fā)酵14h時(shí)，DPPH自由基清除率（58.13%）顯著提高（P＜0.05）；發(fā)酵28 h時(shí)，獼猴桃果漿對(duì)DPPH自由基的清除率為75.25%，與發(fā)酵前相比提高60.82%。

由圖3B可知，與發(fā)酵前獼猴桃果漿的ABTS自由基的清除率（54.60%）相比，發(fā)酵7 h時(shí)，獼猴桃果漿對(duì)ABTS自由基的清除率（51.24%）略微降低（P＞0.05）；發(fā)酵28 h時(shí)，其對(duì)ABTS自由基的清除能力（69.19%）顯著提高（P＜0.05），較發(fā)酵前提高了26.72%。由此可知，植物乳桿菌發(fā)酵獼猴桃果漿有利于提高獼猴桃果漿的抗氧化能力。

圖3 發(fā)酵過程中獼猴桃果漿的DPPH自由基（A）及ABTS自由基（B）清除率的變化Fig.3 Changes of scavenging rate of DPPH free radical(A)and ABTS free radical(B)of kiwifruit pulp during fermentation process

2.4 相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步分析植物乳桿菌發(fā)酵獼猴桃果漿過程中引起獼猴桃果漿抗氧化能力變化的因素，將自由基清除能力與總酚酸、總黃酮以及VC的含量進(jìn)行相關(guān)性分析。DPPH自由基清除能力與總酚酸、總黃酮以及VC的含量的相關(guān)性分析結(jié)果見圖4。

由圖4可知，植物乳桿菌發(fā)酵后的獼猴桃果漿中總酚酸的含量與DPPH自由基清除能力呈正相關(guān)性，R2=0.892，P=0.000；總黃酮含量與DPPH自由基清除能力呈正相關(guān)性，R2=0.603，P=0.017；VC含量與DPPH自由基清除能力無相關(guān)性。

ABTS自由基清除能力與總酚酸、總黃酮以及VC的含量的相關(guān)性分析結(jié)果見圖5。

圖4 DPPH自由基清除能力與總酚酸（A）、總黃酮（B）、VC（C）含量的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of DPPH radical scavenging capacity with total phenolic acid(A),total flavonoids(B)and VC(C)contents

圖5 ABTS自由基清除能力與總酚酸（A）、總黃酮（B）、VC（C）含量的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of ABTS radical scavenging capacity with total phenolic acid(A),total flavonoids(B)and VC(C)contents

由圖5可知，植物乳桿菌發(fā)酵后的獼猴桃果漿中總酚酸的含量與ABTS自由基的清除能力呈正相關(guān)，R2=0.785，P=0.001；總黃酮含量與ABTS自由基清除能力呈正相關(guān)，R2=0.519，P=0.047；VC含量與ABTS自由基清除能力無相關(guān)性。

由此得出，植物乳桿菌發(fā)酵過程中，獼猴桃果漿的自由基清除能力主要與總酚酸和總黃酮的變化有關(guān)。

2.5 植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)獼猴桃果漿酚酸和黃酮組成的影響

經(jīng)相關(guān)性分析，獼猴桃經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，影響了總酚酸和總黃酮的含量，而它們的變化與抗氧化能力密切相關(guān)，因此通過LC-MS檢測植物乳桿菌發(fā)酵前、后獼猴桃果漿中酚酸和黃酮組成的變化，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，發(fā)酵前獼猴桃果漿中共檢測出7種物質(zhì)，以新綠原酸、兒茶素和咖啡酸為主，占總量的89.5%。獼猴桃果漿經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，共檢測出9種物質(zhì)，新綠原酸、6,7-二羥基香豆素和原兒茶酸相對(duì)含量較高，占總量的80.21%。與發(fā)酵前相比，咖啡酸未檢出，新增加了6,7-二羥基香豆素、芥子酸、原兒茶酸。分析原因可能是植物乳桿菌在發(fā)酵過程中，會(huì)產(chǎn)生一些酚酸脫羧酶，使酚類物質(zhì)之間實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化，從而改變其抗氧化活性[28]。兒茶素又稱單寧，可在兒茶素加氧酶的作用下代謝生成原兒茶酸和間苯三酚羧酸[29]。ALBERTO M R等[30]研究發(fā)現(xiàn)，從葡萄酒中分離的希氏乳桿菌（Lactobacillushilgardii）具有代謝兒茶素和沒食子酸的能力。推測獼猴桃果漿中新檢測出的原兒茶酸可能是植物乳桿菌代謝兒茶素生成的。而芥子酸和6,7-二羥基香豆素如何產(chǎn)生，還值得進(jìn)一步研究。

表2 植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)獼猴桃果漿中酚酸和黃酮組成的影響Table 2 Effect of Lactobacillus plantarumfermentation on phenolic acid and flavonoids composition in kiwifruit pulp

由此得出，植物乳桿菌可能參與了獼猴桃酚酸和黃酮的代謝轉(zhuǎn)化，進(jìn)而引起發(fā)酵后獼猴桃果漿抗氧化能力增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究探討了植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)獼猴桃果漿中抗氧化物質(zhì)含量及抗氧化能力的影響。結(jié)果表明，植物乳桿菌發(fā)酵過程中，獼猴桃果漿中植物乳桿菌活菌數(shù)、總酸含量升高，pH值下降；顯著提高了獼猴桃果漿中總酚酸和總黃酮的含量（P＜0.05），進(jìn)而提高獼猴桃果漿的抗氧化能力；獼猴桃果漿抗氧化能力的變化與總酚酸、總黃酮含量的變化密切相關(guān)；植物乳桿菌發(fā)酵參與了獼猴桃酚酸和黃酮的代謝轉(zhuǎn)化，植物乳桿菌發(fā)酵后的獼猴桃果漿中新生成了2,6-二羥基香豆素、芥子酸和原兒茶酸。因此，植物乳桿菌發(fā)酵提高獼猴桃果漿抗氧化能力，是一種提高獼猴桃營養(yǎng)價(jià)值的加工方式。但是，植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)果蔬酚酸和黃酮發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化的機(jī)制，以及這一變化對(duì)果蔬的生物活性產(chǎn)生何種影響并不明確，需要進(jìn)一步研究。