宋 玲 付 瓊

卵巢癌是婦科常見(jiàn)腫瘤，其診斷時(shí)多為晚期，是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1-3]。手術(shù)和化療是卵巢癌最常用的治療方法，近年來(lái)，化療耐藥成為困擾卵巢癌治療的重要問(wèn)題，因此，發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物具有重要的臨床意義。正常細(xì)胞主要通過(guò)線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生能量，然而，大多數(shù)癌細(xì)胞，尤其是實(shí)體腫瘤，即使在氧含量正常的條件下，也主要通過(guò)高速糖酵解產(chǎn)生能量，然后在富含氧的情況下進(jìn)行乳酸發(fā)酵，這被稱為Warburg效應(yīng)[4-6]。與傳統(tǒng)的2 D細(xì)胞培養(yǎng)相比，3 D細(xì)胞腫瘤微球培養(yǎng)可更好的模擬實(shí)體腫瘤缺氧等條件，是腫瘤藥物臨床前評(píng)估較好的細(xì)胞模型[7]。紫云英苷是一種廣泛存在于食品成分中的天然黃酮類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化作用[8-10]。此外，紫云英苷被證實(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的不同類型肝癌及肺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用[11-13]，而對(duì)卵巢癌的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)檢測(cè)紫云英苷對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制，為抗卵巢癌新藥發(fā)現(xiàn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

紫云英苷(Astragaline)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(79851，HPLC純度≥97%)；RPMI1640培養(yǎng)基(11875093)、磷酸鹽緩沖液(PBS，14190144)、胎牛血清(FBS，10099141)購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher科技有限公司；RAPI裂解液(P0013B)、CCK-8試劑盒(C0038)和BCA試劑盒(P0012)購(gòu)于中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；抗β-actin(20536-1-AP)、Glut1(21829-1-AP)、Glut3(20403-1-AP)、HK2(22029-1-AP)、PDK1(10026-1-AP)、PDK3(12215-1-AP)、Bcl2(12789-1-AP)、Bax(50599-2-Ig)和HIF-1α(20960-1-AP)一抗購(gòu)自Proteintech公司；cleaved-caspase-3(9664T)一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；熒光二抗(C40109-04)購(gòu)于美國(guó)LI-COR公司；3 D細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒(CellTiter-Glo?3D cell viability assay，G9683)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；HK2 Elisa試劑盒購(gòu)自上海江萊生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL)中，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 2 D水平培養(yǎng)細(xì)胞增殖活力檢測(cè) OVCAR-8細(xì)胞以3×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，貼壁24 h后更換含不同濃度紫云英苷的培養(yǎng)基100 μL。藥物濃度分別為0(對(duì)照組)、4、11、33和100 μmol/L，分別于24、48、72 h更換CCK-8檢測(cè)試劑100 μL(90 μL RMPI 1640培養(yǎng)基 + 10 μL CCK-8液)，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖活力：細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)× 100%。

1.2.3 3 D水平培養(yǎng)細(xì)胞增殖活力檢測(cè) OVCAR-8細(xì)胞以每孔3×103細(xì)胞接種于每孔含5 μL膠原蛋白的超低粘附96孔板，設(shè)置紫云英苷處理組和對(duì)照組，每組設(shè)置兩組復(fù)孔，每組5個(gè)復(fù)孔，72 h后采用倒置顯微鏡拍照記錄，并采用3 D細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)處理組和對(duì)照組中各自一組復(fù)孔腫瘤微球熒光強(qiáng)度(Luminescence)；后于處理組剩余組復(fù)孔加入紫云英苷(33 μmol/L)，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基為對(duì)照，以加入紫云英苷處理時(shí)為0 h；處理48 h后再次拍照記錄，并采用3 D細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組復(fù)孔腫瘤微球熒光強(qiáng)度；計(jì)算各組相對(duì)0 μmol/L-0 h時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度即為細(xì)胞增殖活力；相對(duì)熒光強(qiáng)度=(紫云英苷組各時(shí)間點(diǎn)或?qū)φ战M48 h時(shí)熒光強(qiáng)度值-檢測(cè)試劑本身熒光強(qiáng)度值)/(對(duì)照組0 h時(shí)熒光強(qiáng)度-檢測(cè)試劑本身熒光強(qiáng)度值)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) OVCAR-8細(xì)胞以每孔2×105細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至完全融合后采用無(wú)菌200 μL槍頭在中央劃痕，PBS沖洗后采用倒置顯微鏡拍照；更換培養(yǎng)基后用11 μmol/L紫云英苷處理24 h，再次使用顯微鏡拍照，以0 μmol/為對(duì)照，以劃痕寬度變化反應(yīng)細(xì)胞遷移能力。

1.2.5 Western blot 以0 μmol/L組為對(duì)照組，采用11和33 μmol/L紫云英苷處理OVCAR-8細(xì)胞或3 D腫瘤微球48 h后使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并使用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白樣品濃度。電泳以每孔30 μg總蛋白量，通過(guò)10%凝膠(SDS-PAGE)電泳后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜；隨后3%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜；于3次TBST洗膜(5 min/次)后加入熒光二抗(室溫孵育1 h)；3次TBST洗膜(5 min/次)后于Odyssey掃描成像儀收集熒光信號(hào)。以β-actin為內(nèi)參照，通過(guò)QuantityOne-v4.6.2軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定進(jìn)行定量分析。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 以0 μmol/L組為對(duì)照組，采用11和33 μmol/L紫云英苷處理OVCAR-8細(xì)胞48 h后消化收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒孵育細(xì)胞后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果采用FlowJo 7.6進(jìn)行分析。

1.2.7 HK2活性檢測(cè) 以0 μmol/L組為對(duì)照組，采用11和33 μmol/L紫云英苷處理OVCAR-8細(xì)胞48 h后提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。設(shè)置空白對(duì)照組及0，11和33 μmol/L組，每組5個(gè)復(fù)孔。每孔加入樣品稀釋液40 μL及待測(cè)樣品10 μL，封板后37℃孵育30 min；打開封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液靜置30 s，并重復(fù)洗滌5次。后每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外，37℃孵育30 min后按上述步驟洗滌5次。每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，37℃避光顯色15 min后加入終止液50 μL。采用酶標(biāo)儀(PerkinElmer Victor3 1420 Multilabel Counter)檢測(cè)450 nm OD值。以對(duì)照組為100%計(jì)算各組HK2活性值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；不同時(shí)間點(diǎn)、不同藥物濃度處理后的細(xì)胞增殖活性、微球直徑以及遷移能力比較采用重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析；相同處理時(shí)間不同藥物濃度組之間蛋白表達(dá)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Tukey法；2 D培養(yǎng)與3 D培養(yǎng)條件下藥物濃度均為0 μmol/L時(shí)蛋白表達(dá)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫云英苷在2 D及3 D細(xì)胞培養(yǎng)水平對(duì)OVCAR-8細(xì)胞增殖活力的作用

與0 μmol/L對(duì)照組相比，采用4、11、33和100 μmol/L紫云英苷處理卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞24、48和72 h后，細(xì)胞活力明顯下降，增殖受到明顯抑制，且呈一定劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A)。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證紫云英苷對(duì)OVCAR-8細(xì)胞增殖的抑制作用，我們使用紫云英苷處理OVCAR-8細(xì)胞腫瘤微球，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，33 μmol/L的紫云英苷在3 D培養(yǎng)水平可明顯抑制OVCAR-8細(xì)胞的增殖活力(圖1B-C)。

圖1 紫云英苷對(duì)OVCAR-8細(xì)胞增殖活力的影響Figure 1 Effect of astragalin on proliferation of OVCAR-8 cellsNote：A.2 D cell culture conditions；aP<0.05，when compared to the negative control group；bP<0.05，when compared to the 4 μmol/L of astragalin group；cP<0.05，when compared to the 11 μmol/L of astragalin group；dP<0.05，when compared to the 33 μmol/L of astragalin group；eP<0.05，when compared to the 48 h group；(B-C).3 D cell culture conditions.*P<0.05，when compared to the 0 h group；# P<0.05，when compared to the negative control group.

2.2 紫云英苷在2 D細(xì)胞培養(yǎng)水平對(duì)OVCAR-8細(xì)胞遷移能力的作用

為進(jìn)一步驗(yàn)證紫云英苷對(duì)OVCAR-8細(xì)胞的抑制作用，我們使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)紫云英苷對(duì)OVCAR-8細(xì)胞遷移的作用，結(jié)果顯示，與0 μM對(duì)照組相比，11 μmol/L的紫云英苷在2 D培養(yǎng)水平可明顯抑制OVCAR-8細(xì)胞的遷移能力(圖2)。

2.3 紫云英苷在2 D及3 D細(xì)胞培養(yǎng)水平對(duì)OVCAR-8細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在2 D培養(yǎng)水平，紫云英苷處理后細(xì)胞凋亡水平明顯增高，且可減少抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，并增加促凋亡蛋白Bax及cleaved-caspase-3的水平(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系(圖3A-B)。與此相似，在3 D培養(yǎng)水平，紫云英苷可明顯減少抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，并增加促凋亡蛋白Bax及cleaved-caspase-3的水平(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系(圖3C)。

2.4 紫云英苷在2 D及3 D細(xì)胞培養(yǎng)水平對(duì)OVCAR-8細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)及活性的影響

在2 D培養(yǎng)水平，紫云英苷可明顯抑制糖酵解相關(guān)蛋白Glut1、Glut3、HK2、PDK1和PDK3的表達(dá)(P<0.05)(圖4A)。與此相似，在3 D細(xì)胞培養(yǎng)水平，紫云英苷可明顯降低糖酵解相關(guān)蛋白Glut1、Glut3、HK2、PDK1和PDK3的表達(dá)(P<0.05)，且均呈一定劑量依賴效應(yīng)關(guān)系(圖4B)。此外，紫云英苷可明顯降低HK2活性，并呈一定劑量依賴效應(yīng)關(guān)系(圖4C)。

圖2 在2 D細(xì)胞培養(yǎng)水平紫云英苷對(duì)OVCAR-8細(xì)胞遷移能力的影響Figure 2 Effect of Astragaline on migration of OVCAR-8 cells in 2 D cultureNote：*P<0.05，when compared to 0 h group；#P<0.05，when compared to 0 μmol/L group；Scale bar is 200 μm.

圖3 在2 D及3 D細(xì)胞培養(yǎng)水平紫云英苷對(duì)OVCAR-8細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of astragalin on apoptosis and its related protein expression in OVCAR-8 cells both in 2 D and 3 D culture conditionsNote：A.Effect of astragalin on apoptosis of OVCAR-8 cells in 2 D culture conditions；B.Effect of astragalin on the expression of Bcl2，Bax and cleaved-caspase-3 in OVCAR-8 cells in 2 D culture conditions；C.Effect of astragalin on the expression of Bcl2，Bax and cleaved-caspase-3 in OVCAR-8 cells in 3 D culture conditions.*P<0.05，when compared to the negative control group；#P<0.05，when compared to the 11 μmol/L of astragalin group.

2.5 紫云英苷可抑制3 D細(xì)胞培養(yǎng)引起的HIF-1α表達(dá)

3 D細(xì)胞培養(yǎng)是腫瘤細(xì)胞缺氧較好的研究模型，而缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α是糖酵解通路及Warburg效應(yīng)重要調(diào)節(jié)因子，在無(wú)紫云英苷作用時(shí)，3 D細(xì)胞培養(yǎng)條件HIF-1α蛋白表達(dá)較2 D培養(yǎng)明顯升高，而紫云英苷作用可明顯減少HIF-1α蛋白表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系(圖5)。

圖4 在2 D及3 D細(xì)胞培養(yǎng)水平紫云英苷對(duì)OVCAR-8細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of astragalin on glycolysis related protein expressions in OVCAR-8 cells both in 2 D and 3 D culture conditionsNote：A.Effect of astragaline on glycolysis related protein in OVCAR-8 cells under 2 D culture；B.Effect of astragaline on glycolysis related protein in OVCAR-8 cells under 3 D culture；C.Effect of astragaline on HK2 activity in OVCAR-8 cells under 2 D culture.*P<0.05，when compared to the 0 μmol/L group；#P<0.05，when compared to the 11 μmol/L group.

圖5 紫云英苷對(duì)OVCAR-8細(xì)胞3 D培養(yǎng)誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白表達(dá)的作用Figure 5 Effect of astragaline under 3 D culture on induction of HIF-1α in OVCAR-8 cellsNote：The concentration of astragaline was 0 μmol/L in 2 D culture is 0 μmol/L；aP<0.05，when compared to 0 μmol/L group in 3 D culture；bP<0.05，when compared to 4 μmol/L group in 3 D culture；cP<0.05，when compared to 11 μmol/L group in 3 D culture；In the comparations between different groups of 3 D culture，F(xiàn)=66.04，P<0.0001；In the comparation between 0 μmol/L group in 2 D and 3 D culture，t=14.34，P=0.0001.

3 討論

Warburg效應(yīng)理論認(rèn)為，即使在氧含量充足的情況下，腫瘤細(xì)胞通常表現(xiàn)出以糖酵解為主的能量代謝，稱為有氧糖酵解[4-6，14-16]。這種由于線粒體功能障礙、缺氧和致癌信號(hào)等導(dǎo)致的代謝變化使得惡性腫瘤細(xì)胞在缺氧等惡性環(huán)境中也具有較好的增殖活性和生成能力。此外，由于增加糖酵解而引起乳酸積累相關(guān)的酸性腫瘤微環(huán)境為選擇具有高生存能力和惡性行為的癌細(xì)胞提供了組織環(huán)境[15-17]。這些腫瘤生物學(xué)改變和微環(huán)境改變?yōu)榘┌Y治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。因此研發(fā)具有糖酵解抑制作用的抗腫瘤藥物對(duì)卵巢癌等惡性腫瘤的防治具有重要臨床意義。葡萄糖通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Glucose transporter，Glut)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞后通過(guò)己糖激酶(Hexokinase)等一系列酶的作用轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸可進(jìn)入線粒體通過(guò)三羧酸循環(huán)生成乙酰輔酶A并釋放較多的三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)，而丙酮酸脫氫酶激酶(Pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)可抑制丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)而促進(jìn)其通過(guò)糖酵解途徑生成乳酸及較少的ATP，從而較少由氧化磷酸化帶來(lái)的活性氧簇累積以及提高代謝速率，從而使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧等惡性腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[18-20]。

紫云英苷是存在于多種食物中的一種天然黃酮類物質(zhì)，有研究表明紫云英甘對(duì)肝癌及肺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，且可抑制肝癌細(xì)胞HK2的表達(dá)[11]，因此我們猜測(cè)，紫云英苷可能通過(guò)抑制糖酵解發(fā)揮抗腫瘤作用。3 D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)因其能更好的模擬實(shí)體腫瘤缺氧微環(huán)境，是評(píng)估抗腫瘤藥物效果較好的細(xì)胞模型。因此我們通過(guò)評(píng)估在2 D及3 D培養(yǎng)條件下紫云英苷對(duì)卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞增殖的作用，確認(rèn)紫云英苷在2 D及3 D培養(yǎng)條件下對(duì)卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞增殖均具有較好的抑制作用。同時(shí)，紫云英苷在2 D及3 D培養(yǎng)條件下均可抑制抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，并促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)及caspase-3的活化。與我們的結(jié)果相似，Chen等的結(jié)果證實(shí)，紫云英苷可促進(jìn)多種肺癌細(xì)胞caspase-3，-8，-9及PARP的活化促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[12]。為進(jìn)一步確定紫云英苷抗腫瘤的機(jī)制，我們采用Western blot方法檢測(cè)了紫云英苷處理后OVCAR-8細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體Glut1和Glut3、己糖激酶HK2以及丙酮酸脫氫酶激酶PDK1和PDK3的蛋白表達(dá)變化，結(jié)果證實(shí)，紫云英苷可顯著降低卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞上述糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)。同時(shí)，為進(jìn)一步證實(shí)紫云英苷對(duì)糖酵解途徑的抑制作用，我們檢測(cè)了3 D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)條件下紫云英苷對(duì)糖酵解相關(guān)蛋白的作用，結(jié)果表明，紫云英苷可明顯抑制卵巢癌OVCAR-8腫瘤微球糖酵解相關(guān)蛋白Glut1、Glut3、HK2、PDK1和PDK3的表達(dá)。這些結(jié)果表明，紫云應(yīng)該可能通過(guò)抑制糖酵解抗腫瘤作用。而缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α是糖酵解途徑的重要調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)抑制三羧酸循環(huán)并促進(jìn)糖酵解途徑從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境的耐受性。在我們的研究中，與2 D細(xì)胞培養(yǎng)相比，3 D細(xì)胞培養(yǎng)可使HIF-1α表達(dá)明顯增多，而紫云英苷處理可顯著降低3 D細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)。此外，有研究證實(shí)，紫云英苷可抑制肺癌細(xì)胞ERK、Akt及NF-κB等信號(hào)通路[12]，而這些通過(guò)都是HIF-1α下游調(diào)控通路。因此，我們推測(cè)，紫云英苷可能通過(guò)抑制HIF-1α誘導(dǎo)的糖酵解途徑及其他多條信號(hào)通路發(fā)揮抗卵巢癌細(xì)胞的作用。

綜上所述，紫云英苷是一種具有潛在抗人卵巢癌作用的活性成分，可通過(guò)抑制HIF-1α誘導(dǎo)的糖酵解等通路來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，為抗卵巢癌新藥的研發(fā)提供重要依據(jù)和參考。