米麗班·霍加艾合買提，阿迪拉·吐爾孫塔依，馬合木提·買買提明

（1.新疆師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院化學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011）

凝血酶是機(jī)體凝血系統(tǒng)中的一種天然成分，是一種在血液凝固系統(tǒng)中起重要作用的絲氨酸蛋白水解酶。凝血酶原是一種糖蛋白，約占總糖含量的11%。凝血酶原被激活，并轉(zhuǎn)化為凝血酶。臨床用于毛細(xì)血管出血的局部止血和外科手術(shù)后組織愈合等，此外作為生化試劑廣泛用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)方面的研究［1］。臨床上所用的凝血酶來源于馬血、牛血或豬血。中國在馬血資源方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)［2］。目前，大部分馬血直接被丟棄掉，一方面造成資源的巨大浪費(fèi)，另一方面也給環(huán)境造成污染。因此對(duì)馬血進(jìn)行研究并加以利用，可以將馬血“變廢為寶”。

對(duì)于凝血酶的獲取，一般都從人血和牛血中分離純化居多，而從馬血中獲取凝血酶的研究甚少。但是，對(duì)馬血進(jìn)行研究并加以利用，馬血凝血酶的研究也將逐漸增大，馬凝血酶的研究也將會(huì)日漸增多。在新疆由于傳統(tǒng)的飲食習(xí)慣和文化特色，每年消耗大量的馬肉、馬乳，因此創(chuàng)辦了一批馬肉、馬乳加工企業(yè)，這些企業(yè)是馬業(yè)產(chǎn)品發(fā)展的基礎(chǔ)。近年來，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，馬的生物、醫(yī)療制品業(yè)應(yīng)運(yùn)而生，促進(jìn)新疆馬業(yè)產(chǎn)品向高、精、尖方向發(fā)展，產(chǎn)生了較好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，直接帶動(dòng)了農(nóng)牧民增加收入，推動(dòng)新疆馬業(yè)向多元化、多領(lǐng)域、高層次方向發(fā)展。

文章探討從馬血中提取純化凝血酶原的方法，通過比較不同的純化方法，以期探索出一種既能提高產(chǎn)率和酶活力，操作又簡單、價(jià)格低廉的純化方法，在工藝和產(chǎn)量上達(dá)到突破，從而滿足人們的需求，進(jìn)一步促進(jìn)醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)的發(fā)展。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

馬血：品種為哈薩克馬。

超濾膜材料：截留分子量為30KDa的再生纖維素（RC）膜。

填充劑材料：D301大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂。

實(shí)驗(yàn)試劑：檸檬酸三鈉、纖維蛋白原、凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品、氯化鈣、檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉、冰乙酸、碳酸氫銨、乙醇等。

1.2 儀器與設(shè)備

TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AL204-IC電子天平，梅特勒托利多儀器有限公司；HH-54數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；60cm×1.5cm玻璃柱，新疆寶信公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 馬血漿的制備

3.8 %檸檬酸三鈉與新鮮馬血以7：1體積比混合攪拌均勻后，以3500r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，除去紅細(xì)胞，收集血漿，裝在400ml錐形瓶里，-10℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 馬凝血酶原的提取

取40ml在4℃解凍的血漿置于燒杯中，以9倍體積的冷卻的純凈水稀釋，充分?jǐn)嚢?，靜置30 min后，用1%醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.1。在5℃靜置6h后，在離心機(jī)以3000r/min速度離心10min，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀混合液溶于0.9%氯化鈉和0.075%草酸鉀溶液的混合液中，攪拌均勻，以3000r/min的速度離心10min后，取1/3樣品于培養(yǎng)皿中，在零下20℃儲(chǔ)存。剩下的2/3的樣品保存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 超濾膜純化凝血酶原

2.3.1 膜純化的原理

使用壓力和離心力使無機(jī)鹽、糖類、水等通過超濾膜，而蛋白質(zhì)分子則不能通過超濾膜，從而達(dá)到濃縮和純化該蛋白的目的。

2.3.2 膜的選擇

純化蛋白質(zhì)最重要的是膜的選擇，并需要考慮純化用的超濾膜的截留分子量和純化蛋白質(zhì)的分子量。

凝血酶原是一種蛋白質(zhì)，分子量為68000Da，存在于血漿中，是血液凝固因子之一。因此，所選用的超濾膜的截留分子量應(yīng)小于68000Da，為保險(xiǎn)起見，本實(shí)驗(yàn)選用截留分子量為30000Da的膜來純化凝血酶原液。

2.3.3 膜純化的步驟

400ml燒杯放入300mL凝血酶原液，在壓力為0.15MPa，溫度為5℃，流速為35.67m/s的條件下用截留分子量為30KDa的RC膜，以2倍濃縮純化凝血酶原液，收集膜上部分，分裝在培養(yǎng)皿中，在零下20℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 真空冷凍干燥

為了得到凝血酶原干粉，將未純化的凝血酶原液與已純化的凝血酶原液分別進(jìn)行真空冷凍干燥24h，真空冷凍干燥能除去近95%的水分，而且蛋白質(zhì)不會(huì)發(fā)生變性，也不會(huì)失去活性，還能夠長期保存，后期使用時(shí)，加水后即可溶解，立即恢復(fù)原狀。

2.5 陰離子交換法純化凝血酶原

2.5.1 離子交換層析法的原理

離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱為陰離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱為陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或提高洗脫液的pH值洗脫下來。

2.5.2 離子交換劑的選擇

常用的離子交換劑有如下三種：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖、離子交換樹脂。在用離子交換樹脂進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時(shí)，pH是重要的因素。提高離子交換層析分辨率和有效成分得率的重要環(huán)節(jié)就是分離物質(zhì)的pI選擇合適的離子交換劑和洗脫強(qiáng)度。因此，本實(shí)驗(yàn)選用樹脂作為交換劑。

2.5.3 樹脂純化凝血酶原的步驟

1.樹脂的預(yù)處理［3，4］

（1）稱取約為35g的樹脂放置于大燒杯中，浸泡于高出樹脂層10cm到20cm的70%乙醇24h；

（2）用乙醇洗至樹脂流出液不渾濁，以避免殘留樹脂碎片等；

（3）用水洗至樹脂無醇味；

（4）以5%HCl浸泡樹脂2-4h，水洗至中性；

（5）以2%NaOH浸泡樹脂2-4h，水洗至中性，備用。

2.裝柱與平衡

（1）將層析柱垂直夾在鐵架臺(tái)上，關(guān)閉出口，向柱中加入1/3柱體積的蒸餾水；

（2）將處理好的樹脂連續(xù)加入柱中，使其自然沉降。待樹脂沉降約5cm后，打開出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使樹脂繼續(xù)沉降，待沉積面上升至距頂端處約5cm時(shí)，關(guān)閉出水口；

（3）洗脫液為0.05mol/L碳酸氫銨（pH=8），以0.5mL/min的流速平衡層析柱，并始終保持樹脂上端有一段液體，以免產(chǎn)生氣泡影響層析效果。

3 上樣與洗脫

實(shí)驗(yàn)成功或者失敗的最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是樣品上柱。如果樣品稀釋或者上柱不均，將會(huì)影響層析效果。上樣時(shí)要盡量保持床面的穩(wěn)定。首先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距柱床表面1-2mm時(shí)，關(guān)閉出口，然后用滴管將1mL樣品緩緩地加至柱床表面，應(yīng)避免樹脂被沖起。最后打開出口并開始計(jì)算流出體積。

當(dāng)樣品滲入柱床中接近床表面1mm時(shí)關(guān)閉出口。按加樣操作，用少量（約1mL）碳酸氫銨洗脫液沖洗管壁2次。最后在樹脂上加入少量洗脫液，并使液體高出柱床表面3-5cm，出口洗脫液流速調(diào)節(jié)為0.5mol/min，依次用不同體積分?jǐn)?shù)的NaCl與碳酸氫銨（20%、40%、60%、80%、100%）混合液進(jìn)行洗脫。出口處用10mL量筒接樣后移入小瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4 收集與鑒定

每10mL收集一瓶樣液，并給每瓶編號(hào)。收集完畢后，將樣液分組，激活測(cè)凝血酶活力。共收集樣液55瓶，分為11組。第一次激活后測(cè)出23號(hào)與28號(hào)有活力。經(jīng)擴(kuò)大范圍，第二次激活后測(cè)出23號(hào)至30號(hào)有活力，其中27號(hào)活力最高，其洗脫液NaCl的體積分?jǐn)?shù)為60%。

4.1 凝血酶活力的測(cè)定

利用凝血酶催化纖維蛋白原凝固的原理測(cè)定其活性。酶活力的單位定義：在最適溫度下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量為一個(gè)國際單位（U）［5］。

4.1.1 凝血酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在72mL 0.9%NaCl溶液中，加入90mg纖維蛋白原，配制成纖維蛋白原溶液，并置于8支離心管中，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

在4支試管中分別配制凝血酶原濃度為5.0 U/mL，6.4 U/mL，8.0 U/mL，10 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液選用0.9%NaCl溶液［6］。

另取4支試管，各試管分別加入0.9mL精密量的纖維蛋白原溶液，置于37℃水浴中保溫5min后，再分別取上述4種各標(biāo)準(zhǔn)溶液為0.1mL濃度的溶液，迅速加入上述各管中，搖勻，立即計(jì)時(shí)，置于37℃水浴中，觀察纖維蛋白原的初凝時(shí)間，每種濃度測(cè)5次，求平均值［5］，如表1所示。

表1 纖維蛋白原凝結(jié)時(shí)間

7 1 6 4 6 6 6 4 3 4 5平均值1 2 1 1 1 0 1 0 6 1 1 3 9 5 1 0 3 1 0 1 9 8 8 4 8 9 9 3 8 5

根據(jù)凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品與纖維蛋白原的凝結(jié)時(shí)間對(duì)應(yīng)的結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，凝結(jié)時(shí)間的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)［6］，計(jì)算方程，如圖1所示。

圖1 凝血酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.1.2 凝血酶原的激活

在試管中，加入體積為5ml的凝血酶原夜，加入濃度為0.1mol/L的CaCl2溶液，在溫度為30℃的條件下激活2.5h。

4.1.3 凝血酶活力的測(cè)定

在試管中分別加入體積為0.9ml的纖維蛋白原液，在37℃水浴中保溫5min，然后加入體積為0.1ml的凝血酶溶液，搖勻，立即置于37℃水浴中，觀察纖維蛋白原的凝血時(shí)間。測(cè)3次求平均值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得酶活力。以此方法分別測(cè)出未分化凝血酶原液、超濾膜純化凝血酶原液、樹脂純化凝血酶原液激活后的活力。

5 結(jié)果

5.1 等電點(diǎn)提取凝血酶原

按7∶1添加3.8%的檸檬酸三鈉后的10L馬血，經(jīng)離心后得到5675mL血漿，提取率為56.75%，除去部分損耗血漿，真空冷凍干燥后得到凝血酶原干粉5g。

5.2 不同純化方法的凝血酶活力

表2 不同純化方法的凝血酶活力

由表2可以看出經(jīng)超濾膜純化后，凝血酶活力提高了130 U/mL，提高到未純化粗酶的2.1倍，經(jīng)大孔樹脂純化后，凝血酶活力提高了182 U/mL，提高到未純化粗酶的2.5倍。

6 結(jié)論

凝血酶原的提取方法有多種，本實(shí)驗(yàn)選用等電點(diǎn)沉淀法提取。超濾膜純化凝血酶原是將粗凝血酶原液中的各種無機(jī)鹽、各種單糖等除去，達(dá)到濃縮和純化凝血酶原液的目的。大孔樹脂離子交換法的原理是用所帶電荷種類和數(shù)量不同的蛋白質(zhì)，能達(dá)到分離開凝血酶原液中的不同蛋白質(zhì)的目的。采用這種分離純化方法分離純化蛋白質(zhì)時(shí)也能夠增加具有活力的蛋白質(zhì)濃度，因此相比于超濾膜純化酶的活力也有提高。因此，大孔樹脂純化效果明顯優(yōu)于超濾膜純化效果。

凝血酶原液的粗酶活力為119 U/mL，超濾后酶活力為249 U/mL；大孔樹脂純化后酶活力為301 U/mL。結(jié)果表明大孔樹脂的純化效果優(yōu)于超濾膜的純化效果。如果將超濾膜純化與大孔樹脂陰離子交換層析法結(jié)合起來，就會(huì)得到活力較高的凝血酶產(chǎn)品。