田 莉，盧軼男，朱 建，張佑紅

武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

血栓相關(guān)的心血管疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，世界上每年都有1 700萬(wàn)人死于這些疾病。不溶性纖維蛋白的堆積是形成血栓的主要原因，且會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致各種心血管疾病的并發(fā)癥，因此預(yù)防和治療心血管疾病的關(guān)鍵是降解不溶性纖維蛋白。目前治療心血管疾病的臨床藥物主要有尿激酶、鏈激酶、纖溶酶原激活劑等［1］。納豆激酶（nat?tokiase，NK）來(lái)源于日本的傳統(tǒng)食物納豆，是一種絲氨酸蛋白酶，對(duì)溶解纖維蛋白有顯著的作用，相比其他治療血栓的臨床藥物，NK具有半衰期長(zhǎng)，無(wú)副作用，價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)［2］。

NK在pH 6-12表現(xiàn)出高活性且穩(wěn)定，不僅可以直接溶解纖維蛋白，而且可以促進(jìn)細(xì)胞釋放組織型纖溶酶原激活劑；NK還能催化尿激酶原從肝臟釋放，從而激活循環(huán)中的纖溶酶原［3］；此外NK還可以降低血漿中的纖維蛋白原、凝血因子VII和凝血因子VIII［4-5］。NK作為潛在的新一代治療心血管疾病的臨床藥物，具有安全、高效、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)［6-7］，另外NK保健品也相繼出現(xiàn)在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，NK未來(lái)的應(yīng)用前景十分廣闊。

目前，NK多通過(guò)從納豆食品中篩選出的納豆芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)［8-9］。野生菌株合成NK的途徑復(fù)雜，且雜蛋白較多，導(dǎo)致后期分離純化的過(guò)程復(fù)雜，較難分離出高純度成品［10］。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了一株能夠高效表達(dá)NK的以枯草芽孢桿菌WB800N為宿主細(xì)胞的基因工程菌株。本研究以該菌株為出發(fā)菌株，利用響應(yīng)面Box-Behnken模型對(duì)液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高納豆激酶的酶活力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌工程菌（PHT43-WB800N）為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏菌株，可重組高效表達(dá)NK酶。

1.1.2 主要試劑 尿激酶（1 240 IU/支，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司）；纖維蛋白原和凝血酶（上海源葉生物科技有限公司）；IPTG來(lái)源于Bio Basic Inc；胰蛋白胨粉和酵母提取物粉（英國(guó)Oxoid公司）；氯霉素（上海生工生物工程有限公司）；大豆蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、淀粉、纖維素、檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3等（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂粉3%、pH 7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、pH 7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、K2HPO41.5 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO40.5 g/L、CaCl20.5 g/L、NaCl 10 g/L、谷氨酸鈉10 g/L、檸檬酸鈉 20 g/L、pH 7.2～7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 用接種環(huán)取少量甘油菌株至LB（含Cm5抗生素）平板上劃線，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基（含Cm5抗生素），37℃，200 r/min，搖瓶培養(yǎng)12 h，活化菌種。按2%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基（含Cm5抗生素），37℃，200 r/min，搖瓶培養(yǎng)8 h，即為發(fā)酵種子液。

1.2.2 發(fā)酵條件 取2%接種量的種子液接種至250 mL錐形瓶（內(nèi)含50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基且含有Cm5抗生素）中，37℃，200 r/min，搖瓶培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.6時(shí)，加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)6 h。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)來(lái)考察碳源、氮源種類和質(zhì)量濃度、谷氨酸鈉質(zhì)量濃度、檸檬酸鈉質(zhì)量濃度、金屬鹽離子質(zhì)量濃度、接種量和pH等因素對(duì)NK酶活力的影響。其中碳源：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、甘油、乳糖、纖維素、可溶性淀粉，質(zhì)量濃度均為20 g/L；氮源：大豆蛋白胨，蛋白胨，胰蛋白胨，酵母粉，NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3，質(zhì)量濃度均為20 g/L。氮源、碳源、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NaCl濃度梯度設(shè)為 0 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L；MgSO4、CaCl2、K2HPO4、KH2PO4質(zhì)量濃度梯度設(shè)為 0 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L。接種量分別為：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；pH分別取值：5、6、7、8、9、10。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用軟件Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken模塊對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、MgSO4、CaCl2和pH五因素三水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，從而確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.2.5 酶活檢測(cè) 本研究采用纖維蛋白平板法檢測(cè)NK酶活性［11］，實(shí)驗(yàn)中所需要的尿激酶溶液、凝血酶溶液、瓊脂糖溶液和纖維蛋白原溶液均為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）配制。向50 mL錐形瓶中加入5 mL瓊脂糖溶液（10 g/L）、5 mL纖維蛋白原溶液（2.2 g/L）和100 μL（10 IU）凝血酶，混勻，及時(shí)倒入潔凈干燥的培養(yǎng)皿中，室溫放置1 h，待纖維蛋白凝塊形成后打孔備用。稀釋8個(gè)不同濃度的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，繪制納豆激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，其具體實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)參考文獻(xiàn)［12］。取1 mL發(fā)酵液，8 000 r/min，離心2 min，向纖維蛋白平板中加入4 μL上清液，37℃，孵育18 h，測(cè)量溶纖透明圈的直徑，根據(jù)透明圈面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到對(duì)應(yīng)的NK酶的酶活力大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，NK標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系為Y=2.373 55X-107.619 52，R2=0.998。根據(jù)測(cè)量纖維平板上透明圈的直徑，計(jì)算出透明圈面積，再利用NK標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系，則可以計(jì)算出發(fā)酵液纖溶酶活力。

圖1 NK標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Nattokinase standard curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同碳源和氮源對(duì)NK酶活性的影響 如圖2（a）所示，有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源相比，有機(jī)氮源能明顯提高NK酶活力。其中以蛋白胨為氮源時(shí)，NK酶活力最高達(dá)到1 340.92 IU/mL；其次是以酵母粉為氮源時(shí)，NK酶活達(dá)到1 175.43 IU/mL；無(wú)機(jī)氮源（NH4）2SO4相比其他無(wú)機(jī)氮源表現(xiàn)出較高酶活；這是因?yàn)镹K酶是一種絲氨酸蛋白酶，其酶活可能需要蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的參與［13］。因此選蛋白胨為該工程菌株的最佳氮源，這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致［14］。由圖 2（b）可知，不同碳源表現(xiàn)出的酶活差別不大，其中以葡萄糖為碳源時(shí)，NK酶活最高達(dá)到1 330.29 IU/mL；其次是以可溶性淀粉為碳源時(shí)，其NK酶活為1 157.75 IU/mL；乳糖被吸收利用的效果低于其他碳源。因此選葡萄糖是該菌株的最佳碳源，此前也有相同報(bào)道［15-17］。

2.2.2 不同濃度碳源和氮源濃度對(duì)NK酶活的影響 有文獻(xiàn)［18］報(bào)道，谷氨酸鈉是NK酶表達(dá)的顯著影響因子，谷氨酸鈉能夠促進(jìn)NK酶活力；檸檬酸鈉是三羧酸循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，能促進(jìn)谷氨酸的合成，從而能提高NK酶的活力。因此本實(shí)驗(yàn)研究了不同質(zhì)量濃度谷氨酸鈉和檸檬酸鈉對(duì)NK酶活的影響。圖3（a）顯示，不同質(zhì)量濃度的谷氨酸鈉和檸檬酸鈉對(duì)NK酶活性影響不大，這說(shuō)明不同菌株間的合成調(diào)控機(jī)制不一樣，對(duì)酶活影響的因素有差異。當(dāng)不添加蛋白胨時(shí)，NK酶活力極低；隨著蛋白胨質(zhì)量濃度的增加，NK酶活力逐漸增加，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，NK酶活達(dá)到最大值1 320.64 IU/mL；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度大于40 g/L時(shí)，NK酶活明顯下降；因此初步選擇蛋白胨適宜質(zhì)量濃度為20 g/L。不添加葡萄糖時(shí)，NK有少量活性，此時(shí)谷氨酸鈉和檸檬酸鈉可以充當(dāng)碳源；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，NK酶活性達(dá)到最大值；因此葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L是最佳碳源濃度。

圖2 對(duì)NK酶活性的影響：（a）氮源，（b）碳源Fig.2 Effects on nattokinase activity：（a）nitrogen source，（b）carbon source

2.2.3 不同金屬鹽離子濃度對(duì)NK酶活性的影響如圖3（b）所示，當(dāng) NaCl質(zhì)量濃度為 10 g/L時(shí)，NK表現(xiàn)出最高活性；隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，NK酶活呈下降趨勢(shì)；當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度接近40 g/L時(shí)，NK酶活下降顯著；因此最佳NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L。不同質(zhì)量濃度K2HPO4和KH2PO4對(duì)NK酶活性影響不大，MgSO4和CaCl2對(duì)NK酶活性影響顯著。當(dāng)MgSO4質(zhì)量濃度由0 g/L增加至1 g/L時(shí)，NK酶活呈明顯上升趨勢(shì)，隨著MgSO4質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)，NK酶活開(kāi)始逐漸下降；當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度由0 g/L～0.5 g/L時(shí)，NK酶活呈明顯上升趨勢(shì)，隨著CaCl2質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)，NK酶活開(kāi)始呈下降趨勢(shì)；因此最佳MgSO4質(zhì)量濃度為1 g/L，最佳CaCl2質(zhì)量濃度為0.5 g/L。

2.2.4 不同pH和接種量對(duì)NK酶活的影響 如圖4（a）所示，pH值對(duì)NK酶活影響略大，當(dāng)pH值為6～9時(shí)，NK表現(xiàn)出高活性，差異不明顯；其中當(dāng)pH為7.0時(shí)，NK酶活性相對(duì)較高；在強(qiáng)酸性條件，NK酶表現(xiàn)出低活性，這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，納豆激酶缺乏功能和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［19］。圖 4（b）中，接種量對(duì)NK酶活性影響不明顯，當(dāng)接種量為3%時(shí)，NK酶活力略高。

圖3 對(duì)NK酶活的影響：（a）碳源和氮源質(zhì)量濃度，（b）金屬鹽離子質(zhì)量濃度Fig.3 Effects on nattokinase activity ：（a）carbon and nitrogen source mass concentration ，（b）ion salts mass concentration

圖4 （a）不同pH值和（b）接種量對(duì)NK酶活的影響Fig.4 Effect of（a）pH and（b）inoculation amount on nattokinase activity

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì) 以蛋白胨（A）、葡萄糖（B）、MgSO4（C）、CaCl2（D）、pH（E）為自變量，以透明圈直徑為響應(yīng)面值，進(jìn)行五因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，五因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面因素水平表Tab.1 Factors and levels in response surface analysis

2.3.2 模型建立及顯著性分析 利用軟件Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken模塊對(duì)表2進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到透明圈直徑（Y）二次多元回歸模型方程：

Y=26.21+3.34A+2B+4.25C-0.590+

0.94E-0.62AB+1.11AC-0.13AD-0.56AE+

0.89BC+0.45BD+2.36BE+0.68CD+0.48CE+

1.36DE-2.21A2-2.63B2-2.85C2-1.89D2-0.91E2

回歸方程決定系數(shù)R2=0.914 7，信噪比RSN=13.754。由表3可知，模型F值為13.41，P＜ 0.000 1，顯著性顯示為極為顯著，表明回歸方程的擬合度和可信度較高，可用此模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

由表3可知，蛋白胨（A）、葡萄糖（B）和MgSO4（C）方差分析表中P＜0.000 1，說(shuō)明A，B，C對(duì)NK酶活影響是極為顯著的；交叉項(xiàng)BE對(duì)酶活的影響顯著；其他交叉項(xiàng)對(duì)酶活影響不顯著；平方項(xiàng)A2，B2，C2，D2對(duì)酶活影響極為顯著。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Tab.3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model Analysis of variance table

2.3.3 響應(yīng)面分析 圖5為響應(yīng)面分析曲面圖和等高線圖，反應(yīng)了五因素之間的相互交叉作用對(duì)酶活的影響。根據(jù)模型求響應(yīng)面的極值點(diǎn)，最佳發(fā)酵條件為：蛋白胨26.05 g/L，葡萄糖29.29 g/L，MgSO41.5 g/L，CaCl20.74 g/L，pH 9.0，NK 酶最高酶活為2 246.33 IU/mL。以最佳發(fā)酵條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取NK酶活平均值為2 186.17 IU/mL，與預(yù)測(cè)值接近，表明該模型是可行的，具有一定的實(shí)踐價(jià)值。

圖5 各因素間相互作用對(duì)納豆激酶酶活影響：（a）（b）蛋白胨質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度相互作用，（c）（d）蛋白胨質(zhì)量濃度和MgSO4質(zhì)量濃度相互作用，（e）（f）葡萄糖質(zhì)量濃度和pH相互作用Fig.5 Response surface plots and contour line showing the interaction between each factor and nattokinase activity：（a）（b）effects of petone and glucose mass concentration interaction on nattokinase activity，（c）（d）effects of petone and MgSO4mass concentration interaction on nattokinase activity，（e）（f）effects of glucose mass concentration and pH interaction on nattokinase activity

3 結(jié) 語(yǔ)

本次研究對(duì)影響枯草芽孢桿菌基因工程菌株產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行了初步探討。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面Box-Behnken模型優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)，其中有機(jī)氮源的利用率明顯高于無(wú)機(jī)氮源，這可能是因?yàn)镹K酶活需要蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的參與；不同碳源對(duì)酶活影響不大，從經(jīng)濟(jì)角度來(lái)考慮可以選擇可溶性淀粉作為碳源；金屬離子K+和PO43-對(duì)NK活性影響不明顯，而Mg2+和Ca2+對(duì)NK活性影響顯著；該菌株在pH 6～9的環(huán)境下，生長(zhǎng)狀態(tài)良好且產(chǎn)物NK表現(xiàn)出高酶活。本次研究獲得了NK最優(yōu)液體發(fā)酵條件：蛋白胨 26.05 g/L，葡萄糖 29.29 g/L，MgSO41.5 g/L，CaCl20.74 g/L，NaCl 10 g/L，pH 9.0，接種量3%。在最佳發(fā)酵條件下，IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵6 h，NK獲得最高酶活為2 186.17 IU/mL，比優(yōu)化前提高了269%?；蚬こ叹纫吧臧l(fā)酵產(chǎn)物NK表現(xiàn)出更高活性，且發(fā)酵產(chǎn)物雜蛋白少，為高純度的NK的高產(chǎn)化奠定了一定的基礎(chǔ)，為未來(lái)制備預(yù)防、治療血栓等心血管疾病臨床藥物的開(kāi)發(fā)提供了新思路［20］。