谷漫峽,王平漢,陳 雛,杜俊蓉*

1四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都 610041；2四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都 610041

偏頭痛是一種常見(jiàn)的由多種復(fù)雜的因素導(dǎo)致的慢性神經(jīng)血管系統(tǒng)紊亂性疾病。偏頭痛發(fā)作具有中重度搏動(dòng)性特點(diǎn)，常表現(xiàn)為單側(cè)發(fā)作、并伴隨有惡心、嘔吐、畏光、畏聲等中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性癥狀[1]。

天麻素是從天麻塊莖提取的主要活性成分之一，具有抗驚厥、抗癲癇、止痛、鎮(zhèn)靜等藥理學(xué)功效。已有研究證實(shí)，天麻素能明顯改善偏頭痛患者的發(fā)作頻率和程度[2]。目前，天麻素作為一種主要的神經(jīng)治療藥物已普遍應(yīng)用于臨床。然而由于天麻素的結(jié)構(gòu)限制，不易通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，使其進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用療效較差[3]。因此，我們合成了阿魏酸與天麻素的酯類衍生物，以提高天麻素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中的作用。其中阿魏酸是治療心腦血管疾病藥品的基本原料，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛等活性。天麻素、天麻素衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

辣椒堿是紅辣椒中的一種辛辣成分，具有脂溶性。研究發(fā)現(xiàn)，它可通過(guò)與1型瞬時(shí)受體電位辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid type 1 receptor，TRPV1)結(jié)合，活化外周和中樞神經(jīng)末梢的三叉痛覺(jué)感受傳入神經(jīng)，導(dǎo)致外周初級(jí)神經(jīng)元和中樞次級(jí)神經(jīng)元的激活，促進(jìn)疼痛相關(guān)信號(hào)的活化以及相關(guān)炎癥因子的釋放，產(chǎn)生中樞和外周的應(yīng)答反應(yīng)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，小腦延髓池內(nèi)滴注辣椒堿能激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)(trigeminovascular system，TGVS)進(jìn)而誘發(fā)偏頭痛樣癥狀[5,6]。

本研究采用小腦延髓池滴注辣椒堿致大鼠偏頭痛模型，來(lái)探討新型天麻素衍生物在辣椒堿所致急性偏頭痛中的療效及其作用機(jī)制。

圖1 Gas、Gas-D化學(xué)結(jié)構(gòu)及其氣相色譜圖Fig.1 Chemical structures and UPLC chromatograms of Gas and Gas-D

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠，體重280～330 g，購(gòu)自四川省成都市達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK(川)2014-189。常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水與攝食。飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持 24 ± 1 ℃ ，相對(duì)濕度 50% 左右。

1.2 試劑及儀器

辣椒堿(北京百靈威)、Gas(成都曼斯特)、Gas-D(由四川中醫(yī)科學(xué)院陳雛副教授制備)(結(jié)構(gòu)如圖1所示)、NO測(cè)定試劑盒(南京建成)、CGRP ELISA Kit(武漢優(yōu)爾生)、山羊抗pERK抗體(Santa Cruz)、兔抗c-Fos抗體(北京中杉金橋)、雞抗CGRP抗體(Neuromics)、β-actin(Santa Cruz)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天)。。

Varioskan Flash全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher)、Gel Pro Analyzer 6.0(Media Cybernetics，美國(guó))、 Gel Doc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)、DS-Fi1c 正置熒光顯微鏡(NiKon，Japan)、冰凍切片機(jī)(LEICA RM2245，Nussloch,Germany)。

2 方法

2.1 偏頭痛動(dòng)物模型的建立及給藥

48只大鼠隨機(jī)均分為六組：空白對(duì)照組、模型組、天麻素組(Gas100、Gas50)及天麻素衍生物組(Gas-D100、Gas-D50)。預(yù)防灌胃給藥 1 h，劑量10 ml/kg，空白對(duì)照組、模型組給予溶媒。

腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，固定，5 min內(nèi)小腦延髓池內(nèi)注入辣椒堿溶液(100 μL， 10 nmol)，空白對(duì)照組給予等量溶媒。隨后將大鼠頭高位30°放置30 min，再俯臥位90 min后處死[6]。

2.2 藥物配制方法

辣椒堿溶液：將辣椒堿溶于10%無(wú)水乙醇、10%吐溫80和0.9% NaCl溶液(1∶1∶8)的溶媒中配成5 mM的濃溶液，4 ℃保存，臨用前將其用0.9% NaCl溶液稀釋成0.1 mM，超聲使其充分溶解。

Gas、Gas-D：溶于0.5% CMC-Na溶液中，充分混勻，使其終濃度為100 mg/kg或50 mg/kg的溶液。

2.3 標(biāo)本處理

造模2 h后，腹腔注射水合氯醛深度麻醉大鼠，頸外靜脈取血。采集血樣后，灌流，取右側(cè)TG、TNC，固定脫水，存于-80 ℃；取腦、TNC及左側(cè)TG液氮速凍后存于-80 ℃。

2.4 NO、CGRP含量測(cè)定

血漿和腦組織中NO以及血漿中CGRP的測(cè)定參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 c-Fos和pERK免疫組化檢測(cè)

固定脫水后的TNC或TG從-80 ℃取出，冰凍切片機(jī)中連續(xù)切片。4%多聚甲醛30 min，0.01 M PBS洗片。0.03%Triton 100，37 ℃，1 h，PBS洗片。3%H2O220 min，PBS洗片，高溫高壓抗原修復(fù)3 min。BSA封閉1 h。兔抗c-Fos(1∶100)或山羊抗pERK(1∶100)37 ℃，1 h， 4 ℃過(guò)夜。PBS洗片。二抗37 ℃，1 h， PBS洗片。SABC 37 ℃，1 h，PBS洗片。 DAB染色1 min，水洗終止。梯度酒精脫水烘干，封片。鏡下采圖，各組切片選取5個(gè)相同視野[7]。

2.6 CGRP免疫熒光檢測(cè)

TNC從-80 ℃取出，冰凍切片機(jī)中連續(xù)切片。4%多聚甲醛30 min，0.01M PBS洗片。0.03% Triton 100 ，37 ℃，1 h,PBS洗片。3%H2O220 min。BSA封閉1 h。雞抗CGRP(1∶100)37 ℃，1 h。4 ℃過(guò)夜，PBS洗片。兔抗FITC IgG(1∶100)37 ℃，避光1 h。PBS洗片，抗熒光猝滅劑封片，鏡下采圖。

2.7 免疫印跡檢測(cè)TNC中c-Fos、CGRP蛋白以及TG中pERK的表達(dá)

取液氮速凍的TG、TNC組織，用RIPA緩沖液提取總蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。隨后采用Western Blot法檢測(cè)TNC中c-Fos蛋白的表達(dá)。提取的蛋白在凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上[10]。將膜置于5%脫脂牛奶(0.5% TBST配制)中封閉1 h。一抗(兔抗c-Fos抗體1∶500；山羊抗pERK抗體1∶200；雞抗CGRP抗體1∶500)孵育，4 ℃過(guò)夜，而后室溫孵育二抗1 h后采用電化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光。每個(gè)波段的光密度值由 Gel Pro Analyzer6.0( Media Cybernetics，美國(guó)) 測(cè)量分析。

2.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 Gas及Gas-D對(duì)NO濃度的影響

結(jié)果如表1，與空白對(duì)照組相比，模型組血漿NO濃度顯著升高(P<0.01)；Gas-D(100或50 mg/kg)對(duì)辣椒堿誘導(dǎo)產(chǎn)生的血漿NO有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性(P<0.01，P<0.05)；在等劑量下，Gas-D的效果更顯著(Gas-D100 與Gas100相比P<0.01；Gas-D50 與Gas50相比P<0.05)，Gas50對(duì)血漿中NO有抑制的趨勢(shì)，但與模型組相比不存在顯著性差異(P>0.05)。

Gas-D100與Gas100均能顯著降低腦組織中NO水平，且組間相比無(wú)差異。與模型組相比，Gas-D50能有效降低腦組織中NO水平(P<0.05)，而Gas50無(wú)此效果(P>0.05)，組間比較存在顯著性(P<0.05)。

表1 各組大鼠血漿及腦組織NO濃度測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of NO concentration of plasma and brain tissue in tars(n = s)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Gas100比較，#P<0.05，##P<0.01；與Gas50比較，△P<0.05，△△P<0.01(下同)。
Note:Compare with model,*P<0.05,**P<0.01;Compare with Gas100,#P<0.05,##P<0.01;Compare with Gas50,△P<0.05,△△P<0.01.(similarly hereinafter).

3.2 Gas及Gas-D對(duì)血漿及TNC中CGRP表達(dá)水平的影響

表2統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組血漿中CGRP水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，Gas-D100與Gas100治療組血漿CGRP濃度均顯著降低(P<0.05，P<0.05)。Gas-D50具有降低血漿CGRP水平的趨勢(shì)，與模型組比無(wú)顯著性差異，而Gas50無(wú)抑制作用(P>0.05)。此外在等劑量下，Gas-D較Gas更有效。

與空白對(duì)照組比，模型組TNC中CGRP表達(dá)水平顯著增多(P<0.01)。與模型組相比，Gas-D 100、Gas100及Gas-D50組能顯著抑制辣椒堿所致CGRP表達(dá)水平增多(P<0.01，P<0.01，P<0.05)，Gas50有抑制CGRP表達(dá)的趨勢(shì)，與模型組比無(wú)顯著差異(P>0.05)。Gas-D與等劑量的Gas相比對(duì)CGRP的抑制作用更顯著。圖2、5分別為IHC和WB法反應(yīng)的各組小鼠TNC中CGRP的表達(dá)情況。

表2 各組大鼠血漿及TNC中CGRP表達(dá)水平結(jié)果Table 2 The results of CGRP expression in plasma and TNC in rats s)

圖2 各組大鼠TNC中CGRP的表達(dá)情況Fig.2 The effects of Gas and Gas-D on CGRP expressions in TNC in capsaicin-induced migraine rats.TNC samples were determined by IF.Representative specimens of CGRP in TNC in different group

3.3 Gas及Gas-D對(duì)TNC中c-Fos蛋白表達(dá)的影響

圖3、5所示，分別為采用IHC和WB測(cè)定TNC組織中c-Fos蛋白表達(dá)情況。鏡下陽(yáng)性細(xì)胞散在分布于TNC，呈灰黑色。各組大鼠陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。模型組 c-fos 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組比較顯著增多(P<0.01)。與模型組相比，Gas-D 100與Gas100組c-Fos蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01，P<0.01)，且Gas-D100與Gas100相比對(duì)c-Fos蛋白表達(dá)抑制作用更顯著(P<0.05)。Gas50無(wú)抑制效應(yīng)(P>0.05)，而可顯著抑制c-Fos蛋白表達(dá)(P<0.05)，Gas-D50與Gas50相比有顯著差異(P<0.05)。此外Gas-D對(duì)c-Fos蛋白表達(dá)的抑制呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。

3.4 Gas及Gas-D對(duì)TG中pERK表達(dá)的影響

Gas及Gas-D對(duì)TG中pERK表達(dá)的影響見(jiàn)圖4、5，其中pERK陽(yáng)性表達(dá)呈深灰色。我們對(duì)各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)下頜神經(jīng)分支(V1)處pERK 陽(yáng)性表達(dá)百分率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[6]，結(jié)果見(jiàn)表4。與空白對(duì)照組相比，模型組pERK 表達(dá)顯著增多(P<0.01)；與模型組相比，Gas-D 100、Gas100及 Gas-D50組均有

組別GroupTNC中c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Number of positive c-Fos neurons in TNC (IHC)空白對(duì)照 control 14±4.86??模型 model 40±10.15Gas50 35±14.53Gas100 25±4.95??Gas-D50 30±14.74?,△Gas-D10021.5±3.82??,#

圖3 Gas及Gas-D對(duì)TNC中c-Fos蛋白表達(dá)情況(IHC)Fig.3 The effects of Gas and Gas-D on c-Fos expressions in capsaicin-induced migraine rats.Cross-sections through the TNC were stained dark brown are the activation marker Fos in neuronal nuclei.Representative specimens of immune-staining of c-Fos protein in different group

抑制作用(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。Gas50有抑制pERK表達(dá)的趨勢(shì)(P>0.05)。Gas-D100和 Gas-D50分別與等劑量的Gas相比，均存在顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。

表4 各組大鼠TG中pERK表達(dá)水平結(jié)果Table 4 The results of pERK expressions in TG in rats(n = s)

圖4 Gas及Gas-D對(duì)TG中pERK表達(dá)情況Fig.4 The effects of Gas and Gas-D on the expression of pERK-IR in TG 2 h after capsaicin infusion.Representative specimens of pERK in TG in different group

圖5 Gas及Gas-D對(duì)TNC中c-Fos/CGRP以及TG中pERK表達(dá)的影響(WB)Fig.5 The results of c-fos protein and CGRP expressions in TNC and pERK in TG(A).The TNC and TG were harvested for WB analysis.The ratio of c-Fos(B)/CGRP(C)/pERK(D) to β-actin was densitometrically analyzed and is expressed as the optical density relative to the model group.The data are expressed as mean ± SD (n = s).*P<0.05,** P<0.01,vs.model group.

4 討論

目前，偏頭痛的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡釋清楚，三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)較為全面的解釋了偏頭痛的病理生理過(guò)程而被廣泛接受[5,6]。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，偏頭痛的發(fā)作源于三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)TGVS的激活，TGVS將外周痛覺(jué)信號(hào)通過(guò)TG傳導(dǎo)至腦干內(nèi)的TNC并進(jìn)一步傳至上級(jí)痛覺(jué)中樞，從而在大腦皮層產(chǎn)生痛覺(jué)[8]。目前，偏頭痛動(dòng)物模型主要為硝酸甘油動(dòng)物模型，但是該模型僅限于偏頭痛樣癥狀，而不足以說(shuō)明偏頭痛的神經(jīng)源性炎癥機(jī)制[5,9]。研究表明，辣椒堿可強(qiáng)烈興奮A-δ和C纖維初級(jí)痛覺(jué)感受神經(jīng)元，激活TRPV1并與之結(jié)合，活化外周和中樞神經(jīng)末梢的三叉痛覺(jué)感受傳入神經(jīng)，導(dǎo)致外周初級(jí)神經(jīng)元和中樞次級(jí)神經(jīng)元的激活，進(jìn)而可以導(dǎo)致TGVS的活化[4-6]。TGVS激活后一方面導(dǎo)致腦膜血管擴(kuò)張、血漿蛋白滲出、神經(jīng)元激活、血管活性物質(zhì)NO[2]、CGRP[2,7,9]等的釋放，這些產(chǎn)物又通過(guò)強(qiáng)烈的擴(kuò)血管作用，加劇神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)；另一方面導(dǎo)致傷害性疼痛標(biāo)志物pERK[10]和疼痛相關(guān)信號(hào)c-Fos蛋白[5,6,9]表達(dá)增多，從而激活下丘腦、腦干及脊髓節(jié)段神經(jīng)，引起三叉神經(jīng)纖維的超敏反應(yīng)，而誘發(fā)頭痛發(fā)作。有研究報(bào)道，小腦延髓池注射辣椒堿可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生急性偏頭痛癥狀[4-6]。因此我們采用辣椒堿所致大鼠急性偏頭痛模型。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，c-Fos參與傷害性感受傳導(dǎo)通路的調(diào)制,常作為神經(jīng)元受刺激后激活的標(biāo)志物[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿能強(qiáng)烈激活c-Fos蛋白的表達(dá)，而在給予天麻素及其衍生物治療后，c-Fos蛋白的表達(dá)被顯著抑制，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。pERK是ERK被激活的磷酸化形式，可介導(dǎo)傷害性刺激通路[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，注射辣椒堿的大鼠TG中pERK的表達(dá)顯著增多，而天麻素及其衍生物均可有效抑制 pERK的表達(dá)。由此推論，Gas、Gas-D能有效抑制TNC中c-Fos蛋白的表達(dá)從而減少TNC神經(jīng)元的激活，并能抑制ERK的磷酸化水平而抑制信號(hào)傳遞，緩解疼痛刺激，減輕偏頭痛癥狀。

CGRP是目前公認(rèn)的作用最強(qiáng)的血管擴(kuò)張肽[2,7]。NO為血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子，可促使血管平滑肌松弛，導(dǎo)致腦膜血管擴(kuò)張而誘發(fā)頭痛[2,9]。有研究報(bào)道，在偏頭痛發(fā)作期，外周血中CGRP 水平增高，且偏頭痛發(fā)作的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間與血中 CGRP 水平呈正相關(guān)[7,9]。本研究結(jié)果顯示，小腦延髓池注射辣椒堿后大鼠血漿和中樞中NO及CGRP的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著升高，NO與CGRP存在共表達(dá)的情況。我們推測(cè)，二者可能協(xié)同發(fā)揮擴(kuò)張腦血管的作用，Gas與Gas-D可能是直接消除中樞的NO，隨后產(chǎn)生抑制CGRP表達(dá)的效果。

綜上，本項(xiàng)研究表明，Gas-D能有效抑制NO、CGRP的水平從而抑制血管擴(kuò)張作用；Gas-D可減少TG中pERK和TNC中c-Fos蛋白的表達(dá)，從而抑制痛覺(jué)信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制TGVS系統(tǒng)的激活，產(chǎn)生抗偏頭痛作用。