王良義 林中滿(mǎn) 王德奮

在我國(guó)胃癌的發(fā)病率居各類(lèi)惡性腫瘤之首，其發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過(guò)程涉及多種細(xì)胞因子及其相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通路和分子機(jī)制。研究表明，胃癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)不僅依賴(lài)于癌細(xì)胞本身的生物學(xué)特性，腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞因子與腫瘤細(xì)胞之間的作用及其各種細(xì)胞因子的相互作用也對(duì)腫瘤惡性增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展的發(fā)生具有重要影響[1-2]。因此，不斷探索新的基因功能和完善分子間相互作用仍是目前的研究熱點(diǎn)。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3，Tim-3)屬于Tim基因家族蛋白，特異性表達(dá)在CD4+IFN-γTh1細(xì)胞表面，隨著其研究的深入，發(fā)現(xiàn)Tim-3在T細(xì)胞亞群CD3+CD8+T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Treg)、樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell，DC)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK)等其他淋巴細(xì)胞亞群也均有表達(dá)[3]。Tim-3屬于細(xì)胞免疫抑制分子，負(fù)向調(diào)控Th1細(xì)胞，通過(guò)Tim-1/galeetin-9途徑對(duì)免疫耐受起著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究將關(guān)注點(diǎn)集中在Tim-3對(duì)腫瘤免疫的作用機(jī)制上。有研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞保持腫瘤免疫抑制環(huán)境，與腫瘤的惡性進(jìn)展緊密相關(guān)[5-6]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃癌組織中Tim-3的表達(dá)及其臨床意義，旨在探討Tim-3與胃癌的臨床病理特征和生存的相關(guān)性及其所起的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年9月1日至2012年9月1日瓊海市中醫(yī)院收治的56例行胃癌根治術(shù)患者的病例資料。56例患者中男性34例，女性22例；年齡29～74歲，平均年齡(56.4±6.4)歲。采集56例患者手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本及相同病例的癌旁組織標(biāo)本，經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋、連續(xù)切片。本研究已經(jīng)通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，患者均知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胃癌；②行胃癌根治術(shù)；③臨床資料及其手術(shù)切除標(biāo)本蠟塊保存完整。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前曾經(jīng)接受放化療、免疫及抗腫瘤藥物等治療；②合并其他惡性腫瘤。

1.3 儀器與試劑

采用自動(dòng)免疫組織化學(xué)分析儀(德國(guó)徠卡Bond公司)；Elivsion試劑盒、DAB顯色試劑盒以及兔抗人Tim-3多克隆抗體均購(gòu)自丹麥Doka公司。

1.4 檢測(cè)方法

免疫組織化學(xué)檢測(cè)Tim-3的表達(dá)采用Elivsion免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)胃癌組織及其癌旁組織中Tim-3的表達(dá)采用Elivsion試劑盒、DAB顯色試劑盒以及兔抗人Tim-3多克隆抗體。嚴(yán)格按照二步法免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 觀察與評(píng)價(jià)指標(biāo)

(1)結(jié)果判斷。陽(yáng)性表達(dá)為定位于腫瘤細(xì)胞漿或細(xì)胞膜的棕黃色或棕褐色顆粒。由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判定，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞＜10%為陰性(-)，≥10%為陽(yáng)性(+)。

(2)生存率隨訪(fǎng)。所有患者出院后通過(guò)電話(huà)，郵件及上門(mén)隨訪(fǎng)生存情況，隨訪(fǎng)終止日期為2017年9月1日，或死亡日期為止。隨訪(fǎng)患者生存期，平均隨訪(fǎng)時(shí)間為(40.7±38.7)個(gè)月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同臨床病理特征患者的Tim-3蛋白表達(dá)比較運(yùn)用卡方檢驗(yàn)，生存資料作Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)并Logrank檢驗(yàn)和多因素分析(Cox模型)和相對(duì)危險(xiǎn)度(relative risk，RR)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中Tim-3表達(dá)比較

Tim-3在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(85.71%)顯著高于癌旁組織(21.43%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=46.52，P＜0.01)，如圖1所示。

圖1 Tim-3在不同組織中的陽(yáng)性表達(dá)

2.2 胃癌組織中Tim-3表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深及肌層的患者胃癌組織中Tim-3表達(dá)明顯高于TNM分期為I～Ⅱ、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未浸潤(rùn)深及肌層的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.962， x2=8.692， x2=6.941；P＜0.01)；而患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤的大小以及組織學(xué)分化對(duì)胃癌組織中Tim-3表達(dá)無(wú)顯著影響(x2=0.012，x2=0.013，x2=0.080，x2=0.051，x2=0.133；P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 Tim-3陽(yáng)性表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

本研究對(duì)56例胃癌患者進(jìn)行了隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)率為100.00%，其中40例存活，16例死亡；生存時(shí)間(32.17±7.93)個(gè)月。Tim-3陽(yáng)性表達(dá)患者的Kaplan-Meier生存率曲線(xiàn)如圖2所示。

對(duì)56例胃癌患者的臨床病理資料進(jìn)行Cox單因素回歸模型分析，其結(jié)果顯示，浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及Tim-3陽(yáng)性表達(dá)與胃癌患者生存率明顯相關(guān)(r=0.674，r=0.613，r=0.596；P＜0.05)；Cox回歸多因素分析表明，浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及Tim-3陽(yáng)性表達(dá)是影響胃癌患者生存率的獨(dú)立預(yù)后因素(RR=2.806，RR=2.239，RR=1.938；P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表1 Tim-3表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性

圖2 Tim-3陽(yáng)性及陰性胃癌患者的生存曲線(xiàn)圖

表2 胃癌患者生存率的Cox回歸多因素分析

3 討論

胃癌患者的臨床表現(xiàn)多為遠(yuǎn)期預(yù)后不良，治療效果不佳。目前胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不完全清楚，其臨床遠(yuǎn)期預(yù)后往往不佳，因此深入探討胃癌發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等惡性進(jìn)展的作用機(jī)制，以尋找評(píng)估胃癌進(jìn)展和預(yù)后的新指標(biāo)，并為胃癌的免疫治療提供新的分子靶點(diǎn)，對(duì)降低胃癌患者的病死率具有重要的臨床價(jià)值。惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及浸潤(rùn)離不開(kāi)腫瘤免疫抑制微環(huán)境，這種免疫抑制微環(huán)境不僅是腫瘤失控性生長(zhǎng)的土壤，更能幫助腫瘤細(xì)胞抵抗和抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)中一群抑制性受體，如細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)在腫瘤免疫逃逸過(guò)程中起主要作用，但其如何幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和攻擊的具體作用機(jī)制尚不明確，也是目前腫瘤免疫研究中關(guān)注的熱點(diǎn)[7]。

Tim-3作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的Th1細(xì)胞表面標(biāo)志分子，由之前被認(rèn)為是一種負(fù)性調(diào)節(jié)分子，現(xiàn)在被歸類(lèi)于免疫系統(tǒng)中抑制性受體，和程序性死亡分子-1(programmed death-1，PD-1)及CTLA-4等一樣，被視為免疫過(guò)程中的關(guān)卡分子。近幾年，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注于其結(jié)構(gòu)、功能及其與自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病和免疫耐受甚至抗腫瘤免疫的關(guān)系，目前有關(guān)Tim-3在腫瘤中的研究大多集中在基礎(chǔ)研究階段，較多腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程均檢測(cè)到Tim-3異常表達(dá)，認(rèn)為T(mén)im-3在腫瘤免疫逃逸和抑制腫瘤免疫應(yīng)答中扮演著非常重要的角色，推測(cè)其機(jī)制可能與Tim-3能夠介導(dǎo)T細(xì)胞耗竭或促進(jìn)髓系來(lái)源抑制細(xì)胞增殖的功能有關(guān)[8-9]。近來(lái)研究資料發(fā)現(xiàn)，Tim-3不僅參與了一些上皮來(lái)源性惡性腫瘤，如胃癌、宮頸癌、肺癌、前列腺癌等的發(fā)生過(guò)程，更可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[10-12]。但國(guó)內(nèi)有關(guān)胃癌中Tim-3的表達(dá)及功能研究并不多見(jiàn)[13]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法測(cè)定Tim-3在胃癌組織中呈異常高表達(dá)，明顯高于癌旁組織，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與此同時(shí)，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深及肌層的患者胃癌組織中Tim-3表達(dá)明顯高于TNM分期為I～Ⅱ、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未浸潤(rùn)深及肌層的患者，提示其在胃癌組織中的異常高表達(dá)不僅參與了胃癌的發(fā)生，可能更進(jìn)一步參與胃癌的惡性進(jìn)展，檢測(cè)到Tim-3高表達(dá)的患者可能提示了其腫瘤惡性進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)比較高，因此Tim-3有望成為胃癌分子靶向調(diào)控的重要靶點(diǎn)，將為胃癌免疫治療提供新途徑。

近年來(lái)，Tim-3與腫瘤預(yù)后的臨床相關(guān)性研究已成為熱點(diǎn)。為此，本研究對(duì)Tim-3表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了初步探討發(fā)現(xiàn)，Tim-3高表達(dá)的胃癌患者生存率明顯低于Tim-3低表達(dá)者，而多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，Tim-3表達(dá)水平是影響胃癌患者生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，提示胃癌組織中Tim-3的表達(dá)差異可能影響其患者的預(yù)后，推測(cè)這可能與Tim-3促使腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞發(fā)生功能耗竭有關(guān)，故Tim-3有望成為胃癌早期預(yù)后評(píng)估的重要分子。

Tim-3在胃癌組織中檢測(cè)到高表達(dá)，其表達(dá)與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及是否浸潤(rùn)深度存在一定相關(guān)性。同時(shí)，胃癌組織中Tim-3的表達(dá)差異可能影響其患者的生存率，但其如何影響胃癌發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。