肖忠新 趙媛媛*

隨著我國(guó)高校辦學(xué)條件的不斷改善，高校擁有的大型儀器逐漸增多，其中包括激光掃描共聚焦顯微鏡精密大型儀器，該儀器設(shè)備可以對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，無(wú)損傷地觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)，已廣泛應(yīng)用在細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)及藥劑學(xué)等研究領(lǐng)域。使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)，對(duì)樣品具有嚴(yán)格要求。有研究指出，樣品所處環(huán)境溫度會(huì)影響樣品熒光強(qiáng)度的觀測(cè)[1-2]。為此，本研究采用4%多聚甲醛緩沖液和甲醇兩種常規(guī)的固定劑，使用之后再加促滲透試劑TritonX-100，觀察其對(duì)細(xì)胞核染色圖像質(zhì)量的影響，通過(guò)樣品的溫度改變和不同樣本固定方法，分析其對(duì)激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

使用Leica TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司公司)觀測(cè)樣品。植物鈴蘭(Convallaria)樣片(德國(guó)Leica公司)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國(guó)Gibco公司)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復(fù)染液(英國(guó)Abcam公司)染料；多聚甲醛緩沖液(江蘇凱基生物公司)；甲醇(分析純，北京化工廠)。激光共聚焦皿[耐思(NEST)江蘇無(wú)錫耐思生物科技有限公司。

1.2 檢測(cè)樣品

檢測(cè)的樣品為植物鈴蘭(Convallaria)樣片，樣片用Fast Green和Safranin兩種染料染色，并使用了防淬滅劑。檢測(cè)不同固定方法的樣品為人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)。用含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS高糖培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)，含封片劑的DAPI復(fù)染液染料，4%的多聚甲醛緩沖液，甲醇，20 mm激光共聚焦皿(NEST)。

檢測(cè)溫度對(duì)共聚焦顯微鏡影響的樣品為德國(guó)Leica公司提供的經(jīng)過(guò)熒光染色的植物鈴蘭(Convallaria)樣片，樣片用Fast Green和Safranin兩種染料染色，并使用了防淬滅劑。檢測(cè)不同固定方法的樣品為人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)， 在20 mm激光共聚焦皿中培養(yǎng)。樣品依據(jù)處理方法的不同分為A組和B組，A組為甲醇處理組(3個(gè)皿)，B組為甲醛處理組(3個(gè)皿)，A組分別使用4%的多聚甲醛緩沖液，甲醇固定。B組在其固定后再加促滲透試劑TritonX-100處理。人正常肺上皮細(xì)胞均使用含封片劑的DAPI復(fù)染液對(duì)細(xì)胞核染色。

圖1 常溫下鈴蘭樣品熒光強(qiáng)度的變化曲線圖

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 分子熒光強(qiáng)度的測(cè)定

使用TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)植物鈴蘭(Convallaria)樣片。物鏡為63倍油鏡，數(shù)值孔徑值為1.4。利用561 nm激光器激發(fā)熒光，探測(cè)器在610～691 nm接收發(fā)射光。同一個(gè)鈴蘭樣片在兩種溫度下進(jìn)行測(cè)定：①在室溫下測(cè)定；②在冰箱-20 ℃冷凍保存12 h，取出后立即用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)樣片熒光強(qiáng)度的變化，隨著時(shí)間的增加，鈴蘭樣品溫度逐步升高。采集鈴蘭樣片圖像時(shí)間均為間隔5 min采集1次，在同一個(gè)視野中連續(xù)采集圖像7次，總共采集30 min。室溫下和-20 ℃冷凍保存的鈴蘭樣片是在相同的掃描參數(shù)情況下，使用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)、采集圖像。分析圖像熒光強(qiáng)度是用萊卡公司LAS AF Lite軟件，計(jì)算每幅圖像中的平均熒光強(qiáng)度。

1.3.2 人正常肺上皮細(xì)胞固定方法的測(cè)定

(1)樣本固定。人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)復(fù)蘇后傳代3代后用于實(shí)驗(yàn)，分為A組和B組，A組采用甲醇處理(3個(gè)皿)；B組采用甲醛處理(3個(gè)皿)。吸凈培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗1次，馬上加入細(xì)胞固定劑。①A組甲醇處理(3個(gè)皿)方法：置于-20 ℃預(yù)冷的甲醇固定10 min，其中兩個(gè)皿僅加PBS，不加TritonX-100，另一個(gè)皿加0.3% TritonX-100作用15 min；②B組甲醛處理(3個(gè)皿)方法：使用新鮮配置的4%多聚甲醛緩沖液室溫固定15 min，吸出甲醛，其中兩個(gè)皿僅加PBS，不加TritonX-100，另一個(gè)皿加0.3%TritonX-100孵育15 min。

(2)細(xì)胞核染色。用封片劑含DAPI的染料染色10 min后，使用PBS清洗3次，每次5 min，然后每個(gè)皿再加入適量PBS。

(3)染色情況。使用TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡觀察DAPI染色情況，各皿所使用物鏡均為63倍油鏡，數(shù)值孔徑值為1.4。采集熒光和明場(chǎng)圖像，單個(gè)細(xì)胞的圖像放大4倍拍攝。使用405 nm激光器激發(fā)DAPI染料，各皿的掃描參數(shù)固定不變。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 溫度對(duì)熒光分子熒光強(qiáng)度的影響

(1)在常溫下鈴蘭樣品熒光強(qiáng)度的變化很小，曲線接近一條水平直線(如圖1所示)。

(2)隨著時(shí)間的增加，鈴蘭樣品溫度增高，逐步達(dá)到室溫(23℃±1℃)時(shí)，平均熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。在接近室溫時(shí)，曲線上升趨勢(shì)漸弱，曲線趨于平緩(如圖2所示)。

圖2 -20℃冷凍保存恢復(fù)到室溫下鈴蘭樣品熒光強(qiáng)度的變化曲線圖

2.2 不同固定方法對(duì)細(xì)胞核染色的影響

采用4%多聚甲醛緩沖液和甲醇兩種固定劑固定后，用DAPI對(duì)胞核染色的效果均不如加入促滲透試劑TritonX-100對(duì)核染色效果好，加入促滲透試劑后，核染色更均勻，且更堅(jiān)實(shí)、清晰(如圖3所示)。

圖3 不同固定方法對(duì)細(xì)胞核染色的影響示圖

3 討論

按照常規(guī)，熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度在低溫時(shí)比高溫時(shí)要高，而樣品加封片劑后，需考慮封片劑對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。有研究指出，保存熒光樣品的丙三醇含量會(huì)影響對(duì)生物介質(zhì)中不同發(fā)射波長(zhǎng)熒光分子的熒光強(qiáng)度[3]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，冷凍保存的熒光樣品溫度逐步達(dá)到室溫時(shí)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸增強(qiáng)，這與本研究偶爾遇到剛從冰箱冷凍保存的樣品取出來(lái)，著急使用共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度的結(jié)果相似。有研究表明，黏度增加使得熒光光強(qiáng)增加[4-7]。Kee等[8]的研究也提示熒光量子產(chǎn)率隨黏度的增加而增大。樣品熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)可能的原因是隨著溫度的升高，樣片中的封片液逐漸解凍，處于低溫下的封片液比常溫下的黏度大，從而導(dǎo)致熒光發(fā)射強(qiáng)度增強(qiáng)。

固定劑影響樣品觀測(cè)已有報(bào)道，范瑾瑾等[9]的研究提示，對(duì)細(xì)胞支架成分的固定適用于有機(jī)溶劑固定劑，交聯(lián)劑固定劑適用于膜相關(guān)成分的固定；張麗麗等[10]的實(shí)驗(yàn)表明，95%乙醇或甲醇作為固定劑固定細(xì)胞后，易導(dǎo)致熒光猝滅；而丙酮或4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，對(duì)質(zhì)粒熒光強(qiáng)度沒(méi)有顯著影響。本研究結(jié)果表明，樣品使用交聯(lián)型固定劑4%多聚甲醛或凝固型固定劑甲醇固定以后，如果再繼續(xù)加入促滲透試劑TritonX-100，可以使細(xì)胞核的通透性增加，便于DAIP與核酸更好地結(jié)合，細(xì)胞核染色效果更清晰。

4 結(jié)語(yǔ)

熒光樣本所處環(huán)境溫度的改變會(huì)引起熒光強(qiáng)度的變化，在做熒光強(qiáng)度比較的實(shí)驗(yàn)時(shí)尤其要注意，應(yīng)在室溫下，同一個(gè)溫度條件進(jìn)行檢測(cè)。從冰箱冷凍保存取出的樣本應(yīng)在室溫下放置30 min以后，再使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)試。樣品在一般固定劑固定以后，再加入促滲透試劑可以使細(xì)胞的通透性增加，染色更加清晰。在使用激光共聚焦顯微鏡時(shí)，如果不注意溫度的改變和固定方法，將影響觀測(cè)結(jié)果。