云耀峰 梁潤 郝靈芳 蒼宏宇 常青

(1.呼和浩特市第一醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其上升幅度居惡性腫瘤之首，且發(fā)病人群逐漸趨向年輕化[1]，故其近年備受關(guān)注，并成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。其常用診斷方法包括觸診、超聲、核素顯像、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢等，其中細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢是篩查和早期診斷甲狀腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在一定的假陰性率和部分無法確診的病例，且需考慮患者的依從性[2-3]。因此，研究鑒定早期診斷預(yù)警分子，是目前甲狀腺癌臨床研究所面臨的瓶頸問題。越來越多的實驗數(shù)據(jù)逐步建立了腫瘤與miRNA表達(dá)變化的關(guān)聯(lián)，提示我們在不同的腫瘤中檢測特定的miRNA表達(dá)變化很可能成為腫瘤診斷、分期和預(yù)后預(yù)測的有力工具[4-5]。為了進(jìn)一步證實其臨床效果，我們進(jìn)行了此次研究，現(xiàn)將結(jié)果報告于下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月～2017年8月多中心收集的行甲狀腺手術(shù)的40例甲狀腺癌(乳頭狀癌、濾泡癌各20例)、癌旁正常甲狀腺組織(N-PTC)及20例良性甲狀腺疾病組織(MNG)。其中男性21例，女性39例；年齡16～65歲，平均(39.2±4.4)歲。采集前所有研究對象均了解研究的整個過程，且自愿參與，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療治療，且不伴有影響研究的相關(guān)疾病，見表1。

1.2 方法 樣本總RNA的提?。簩⒔M織標(biāo)本在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入RNA提取試劑(Trizol試劑)1ml充分混勻，提取組織中總RNA[6]。逆轉(zhuǎn)錄PCR：取總RNA 1μl，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明加入各種反應(yīng)試劑，然后42℃反應(yīng)15min,85℃反應(yīng)5s,4℃反應(yīng)15min，后在-80℃下保存?zhèn)溆肹7]。實時PCR：取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl，加入PCR反應(yīng)試劑。將盛有混合物的反應(yīng)管置于實時PCR反應(yīng)儀中，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15min，再按95℃反應(yīng)15s,60℃反應(yīng)1min，擴(kuò)增40個循環(huán)，實驗重復(fù)3次[8]。

1.3 評價標(biāo)準(zhǔn) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)剛開始進(jìn)入到對數(shù)期的時候，原始模版的體系及濃度等差異暫時沒有放大，擴(kuò)增目的片斷的量可以近似地看作僅僅與擴(kuò)增效率及起始模板的濃度相關(guān)。用Pt值表示擴(kuò)增目的片斷的量，含義是PCR中熒光信號達(dá)到規(guī)定閾值時的循環(huán)數(shù)。內(nèi)參應(yīng)用U6表示，陰性對照選擇水。應(yīng)用2-△△PT值表示樣品目的基因的相對表達(dá)率(PQ)?！鱌Ttumor=Pt(待測基因)-Pt(管家基因 U6)，△PTnormal=Pt(待測基因)-Pt(管家基因 U6),△△PT=△PTtumor-△PTnormal，RQ=T÷N=2-△△PT(變化倍數(shù) fold-change),Log2[T/N]=-△△PT。當(dāng)RQ<1時，表示甲狀腺癌組織中的目的基因的表達(dá)水平較良性病變組織內(nèi)的目的基因的表達(dá)水平低；當(dāng)RQ>1時，表示甲狀腺癌組織中的目的基因的表達(dá)水平較良性病變組織內(nèi)的目的基因的表達(dá)水平高。

表1 兩組研究對象臨床資料比較(n，×10-2)Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

2 結(jié)果

2.1 miRNA與甲狀腺癌的病理關(guān)系 在甲狀腺癌患者中，miR-221、miR-222的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、雙葉腫瘤等指標(biāo)無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而與TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，見表2；miR-222在miR-197和miR-346的表達(dá)在20例甲狀腺濾泡癌中均有明顯升高，其余未見顯著變化，見表3。

表2 miR-221、miR-222的表達(dá)與甲狀腺癌病理及臨床特征的關(guān)系Table 2 The relationship between the expression of mir-221 and mir-222 and thyroid cancer pathology

Table3RelationshipbetweentheexpressionofmiR-197andmiR-346andthepathologicalchangesofthyroidcarcinoma

腫瘤類型nmiR-197表達(dá)量PmiR-346表達(dá)量P乳頭狀癌200.89±0.080.020.93±0.050.00濾泡癌 203.89±0.094.11±0.09

2.2 miRNA分子在相應(yīng)組織標(biāo)本中的表達(dá)水平 miR-221與miR-222在良性甲狀腺疾病組織的表達(dá)量變化不明顯,但是在甲狀腺癌組織中的表達(dá)變化顯著，即在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)顯著，兩者與PTNE的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(t221=-0.12,P221=0.00;t222=-0.13,P222=0.00)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在癌旁正常組織中的表達(dá)無明顯變化，見表4。在良性甲狀腺疾病組織中miR-197和miR-346表達(dá)沒有顯著差異(P>0.05)；在20例濾泡癌組織中明顯升高(P<0.05)，在乳頭狀癌組織及癌旁正常組織中均無明顯變化，見表5。

Table4ExpressionlevelofmiR-221andmiR-222inthecorrespondingtissuespecimens

標(biāo)本miR-221PmiR-222P良性甲狀腺疾病 病灶組織0.34±0.030.240.39±0.050.11 正常組織0.32±0.070.40±0.09甲狀腺癌 病灶組織0.85±0.010.000.99±0.020.00 癌旁正常組織0.31±0.070.40±0.01

3 討論

甲狀腺癌的發(fā)病率雖然只占全身腫瘤的1%、甲狀腺結(jié)節(jié)的5%，但卻是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤之一[9]。甲狀腺癌的發(fā)病隱匿，最初表現(xiàn)為無痛性甲狀腺結(jié)節(jié)，臨床診斷相當(dāng)困難。當(dāng)前多采用超聲、觸診、磁共振、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢、CT及核素顯像等方法進(jìn)行診斷，其中細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢是篩查及早期診斷甲狀腺癌較為有效的方法，但仍然存在一些假陰性和無法確診的病例[10-11]。因此，對早期診斷預(yù)警分子的研究與鑒定成為了目前甲狀腺癌所面臨的瓶頸問題，在臨床上有著重要的價值。

Table5LevelsofexpressionofmiR-197andmiR-346inthecorrespondingtissuespecimens

標(biāo)本miR-197PmiR-346P良性甲狀腺疾病 病灶組織0.35±0.020.270.41±0.050.31 正常組織0.33±0.040.40±0.07甲狀腺癌 病灶組織4.11±0.090.003.89±0.090.00 癌旁正常組織0.41±0.040.40±0.03

近年來，大量臨床數(shù)據(jù)表明多種腫瘤的發(fā)生均與miRNA的異常表達(dá)有著密切關(guān)系，提示我們在不同的腫瘤中對特定的miRNA表達(dá)變化進(jìn)行檢測很有可能會成為腫瘤診斷、分期及預(yù)后預(yù)測的有力工具[12-13]。miRNA是內(nèi)原性非編碼的一類小RNA,以堿基互補(bǔ)的形式與靶基因的表達(dá)相結(jié)合予以調(diào)控。miRNA不僅參與機(jī)體生長發(fā)育等正常生理過程，且在腫瘤等多種疾病的病理發(fā)展中扮演著重要角色[15]。在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，miRNA能夠下調(diào)基因的表達(dá)；與此相反，具有癌基因樣功能的miRNA，能夠?qū)σ职┗虻谋磉_(dá)進(jìn)行抑制。如果這些具有很強(qiáng)控制力的miRNA有了異常的變化，會將癌基因和抑癌基因之間的平衡破壞，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在甲狀腺增生性結(jié)節(jié)是否行手術(shù)切除的判斷中，臨床上多采用術(shù)前細(xì)針穿刺，而miRNA技術(shù)僅僅可以依靠少量的細(xì)針穿刺標(biāo)本就能予以診斷，可有效地對甲狀腺結(jié)節(jié)與甲狀腺腫瘤進(jìn)行區(qū)分，將不必要的甲狀腺切除手術(shù)避免[14-15]。

研究表明，在大多數(shù)腫瘤組織中miRNA分子家族的miR-221和miR-222均呈高表達(dá)水平[16]。本研究也證實甲狀腺癌中miR-221和miR-222的表達(dá)量明顯高于正常甲狀腺組織，表明其對甲狀腺癌的檢查結(jié)果會有一定的診斷輔助作用。在甲狀腺癌中，miR-221和miR-222的高表達(dá)與p27kip1蛋白的低水平表達(dá)有著密切的聯(lián)系，體外將miR-221與miR-222轉(zhuǎn)入到甲狀腺癌細(xì)胞中，會明顯減少p27kip1蛋白的表達(dá)，同時也抑制了兩者的表達(dá)，miR-221與miR-222的調(diào)控位點(diǎn)存在于p27kip1的3’-URT中，而細(xì)胞周期的調(diào)控有p27kip1的參與，充分表明甲狀腺癌細(xì)胞周期的調(diào)控中有miR-221與miR-222的參與。另外，miR-221和miR-222在細(xì)胞的分化及生長過程中也發(fā)揮著重要作用[17-18]。本研究證實，TNM分期越高，miR-221和miR-222的表達(dá)水平也就越高，意味著miR-221和miR-222很可能在參與甲狀腺癌發(fā)展及惡化過程中起到了重要作用；同時在甲狀腺癌存在淋巴轉(zhuǎn)移中的表達(dá)明顯高于非淋巴轉(zhuǎn)移組織，故其與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其機(jī)制可能為miR-221和miR-222抑制了長壽保障基因和蛋白絡(luò)氨酸磷脂酶u等，從而加速了甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移，表明其與復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也有著密切的聯(lián)系。此外，本研究還顯示，miR-221和miR-222在甲狀腺乳頭狀癌中呈負(fù)相關(guān)，表明miRNA在甲狀腺腫瘤的診斷中有著潛在的應(yīng)用價值。

濾泡狀甲狀腺癌的惡性程度明顯高于乳頭狀甲狀腺癌，且兩者多伴隨發(fā)生。在濾泡狀甲狀腺癌的發(fā)生過程中，多種miRNA具有不同程度的高表達(dá)，這種細(xì)胞的表達(dá)多與細(xì)胞的類型有關(guān)系[19]。Weber等[20]研究證實miR-197和miR-346會導(dǎo)致濾泡狀甲狀腺癌133和K5細(xì)胞系的增長停滯，但是對乳頭狀甲狀腺癌卻無影響；亦證實了miR-197和miR-346沉默將會對濾泡狀甲狀腺癌的治療起到很大的促進(jìn)作用。本研究表明，miR-197和miR-346在乳頭狀甲狀腺癌、正常組織和良性甲狀腺疾病組織中的表達(dá)均無顯著性，但在濾泡狀甲狀腺癌中卻呈現(xiàn)高表達(dá)，因此miR-197和miR-346對濾泡狀甲狀腺癌的診斷與治療有著重要的臨床價值。此次研究有如下創(chuàng)新：①發(fā)現(xiàn)某種新型的miRNA，作為甲狀腺癌早期診斷、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的預(yù)警分子，為甲狀腺癌手術(shù)方式選擇及術(shù)后指導(dǎo)治療提供了參考及依據(jù)。②首次通過同一患者多中心性甲狀腺癌miRNA表達(dá)差異性情況，驗證其多灶性起源問題，并有望為今后甲狀腺癌特別是分化型甲狀腺癌手術(shù)術(shù)式提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，不同病理類型及分期甲狀腺癌中miRNA表達(dá)的不同，可為臨床早期診斷、預(yù)后分級、手術(shù)方式及術(shù)后治療提供判斷依據(jù)，可有效提高患者的生存質(zhì)量和預(yù)期壽命，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，減少醫(yī)院醫(yī)療資源浪費(fèi)，合理優(yōu)化醫(yī)療資源配置，具有較好的臨床及經(jīng)濟(jì)價值。