雍磊 劉曉光

作者單位：100191 北京大學第三醫(yī)院骨科

骨肉瘤是臨床最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童及青少年。過去以手術(shù)為主的治療手段只能使患者5 年生存率維持在 20% 左右，從 20 世紀 70 年代開始，化療聯(lián)合手術(shù)的治療方案使患者的 5 年生存率達到 60%～70%[1]。然而，近 30 年來，骨肉瘤的治療效果沒有進一步的提高，這其中一個重要原因是化療耐受的普遍發(fā)生[2]。因此明確化療耐受機制并尋找逆轉(zhuǎn)耐受的新策略成為改善骨肉瘤預后的當務(wù)之急。

自 1978 年被批準使用，順鉑已經(jīng)廣泛用于多種實體瘤如睪丸癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌及肺癌等的治療[3]。作為骨肉瘤四大經(jīng)典化療藥物 ( 阿霉素、大劑量甲氨蝶呤、順鉑和異環(huán)磷酰胺 ) 之一，順鉑發(fā)揮殺傷能力的基礎(chǔ)是與 DNA 結(jié)合，造成 DNA 損傷，但其療效被患者的遺傳性或獲得性耐藥能力大幅削弱，單獨應用時僅在 30%患者中產(chǎn)生應答[4]。與其它三種藥物不同，順鉑是惟一含金屬元素的藥物，這使順鉑在某些關(guān)鍵途徑與其它藥物無交叉耐藥性，所以單獨闡述骨肉瘤耐受順鉑的機制具有重要的治療價值。筆者將對骨肉瘤耐受順鉑的相關(guān)機制研究進展進行綜述，以期為逆轉(zhuǎn)順鉑耐受的探索提供更開闊的視角?，F(xiàn)報告如下。

一、細胞內(nèi)順鉑積累減少

腫瘤細胞內(nèi)順鉑積累的減少是導致耐受順鉑的重要原因[5-6]。研究顯示耐受順鉑的骨肉瘤細胞相對于其親代，胞內(nèi)順鉑積累量大幅降低 ( ＞50% )[7-8]。過去一直認為順鉑僅通過被動運輸進入細胞，近年證實銅離子轉(zhuǎn)運蛋白 1( copper transporter 1，CTR1 ) 介導的主動攝取是順鉑入胞的主要方式[9]。敲除釀酒酵母和小鼠胚胎成纖維細胞的CTR1 基因，二者順鉑積累分別減少 44% 和 70%，同時對順鉑的敏感性顯著降低[10]。在卵巢癌和非小細胞肺癌中，CTR1 表達水平越低，腫瘤細胞中積累的鉑類藥物越少，患者對鉑類藥物的反應越差[11-12]。但骨肉瘤耐受順鉑是否與 CTR1 低表達具有潛在關(guān)系尚未見報道，值得進行探索。除了攝取減少，外排增加同樣降低順鉑的積累量。藥物泵出細胞的途徑多樣，骨肉瘤中的研究目前集中于 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白 ( ATP-binding cassette transporters )。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族是一類具有 ATP 結(jié)合位點的蛋白，通過與 ATP 結(jié)合獲得能量，將多種藥物排出細胞，尤以多藥耐藥蛋白 1 ( multidrug resistance protein 1，MDR1，又稱為 P-糖蛋白 ) 及多藥耐藥相關(guān)蛋白 1 ( multidrug resistance-associated protein 1，MRP1 ) 活躍。MDR1 及MRP1 對于底物無選擇性，大量證據(jù)顯示二者高表達對骨肉瘤耐受阿霉素具有重要意義，抑制 MDR1 及 MRP1 均能增加骨肉瘤細胞對阿霉素的敏感性，然而，卻不能實現(xiàn)對順鉑增敏[13-14]，這提示 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白的外排作用可能不是影響骨肉瘤細胞中順鉑積累的關(guān)鍵因素，其作用尚需要進一步驗證。另外，兩種銅轉(zhuǎn)運 P 型 ATP 酶( P-type ATPase ) ATP7A 及 ATP7B 也促進順鉑耐受，它們能將順鉑隔離在細胞囊泡結(jié)構(gòu)中從而減少細胞內(nèi)的有效順鉑積累量或介導順鉑泵出細胞[15]。在耐受順鉑的腫瘤中，ATP7A 及 ATP7B 表達上調(diào)[16-17]；然而，骨肉瘤中也尚無關(guān)于 ATP7A 及 ATP7B 的研究。

二、細胞解毒能力增強

順鉑進入細胞后，胞內(nèi)低氯離子環(huán)境使順鉑的氯配體解離，同時鉑離子絡(luò)合水分子，形成帶正電的高活性水合分子。這種水合分子僅少部分與 DNA 結(jié)合，其余絕大部分被胞內(nèi)親核物質(zhì)結(jié)合而失去活性，其中最重要的親核物質(zhì)是谷胱甘肽 ( glutathione，GSH )[3]。早在 1998 年，Komiya 等[18]就在 8 株骨肉瘤細胞中發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi) GSH 水平越高，順鉑的半數(shù)抑制濃度就越大；進一步用丁硫氨酸-亞砜亞胺抑制 GSH 合成過程中的關(guān)鍵酶后，順鉑的殺傷效力明顯增強。GSH 與順鉑除了能直接結(jié)合外，還能在谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶 P1 ( glutathinoe S-transferase P1，GSTP1 )的催化下快速反應，Huang 等[19]報道順鉑上調(diào)骨肉瘤細胞 SaOS-2 和 HOS 中 GSTP1 的表達，在 SaOS-2 細胞中過表達 GSTP1 后，細胞對順鉑的抵抗能力增強；相反，在HOS 細胞中干擾 GSTP1 的表達后，細胞對順鉑的敏感性上升。單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphisms，SNP ) 分析顯示骨肉瘤患者攜帶 GSTP1 rs1138272 與無瘤生存期和總生存期相關(guān)[20]。Pasello 等[21]在 34 例骨肉瘤患者中發(fā)現(xiàn) GSTP1 水平越高，腫瘤復發(fā)可能越大，患者無瘤生存期越短；進一步將順鉑與 GSTP1 抑制劑序貫干預細胞，顯示出協(xié)同抗腫瘤效應。

三、DNA 損傷修復或耐受增強

順鉑水合分子傾向于結(jié)合 DNA 嘌呤堿基的 N7 位點，形成順鉑-DNA 交聯(lián)物，其中絕大部分為鏈內(nèi)交聯(lián)，少部分為鏈間交聯(lián)。細胞若不能修復或耐受 DNA 損傷，就會啟動下游凋亡途徑；反之，部分細胞能修復或耐受這些 DNA 損傷從而耐受順鉑。核苷酸切除修復 ( nucleotide excision repair，NER ) 是修復鏈內(nèi)交聯(lián)的主要方式，其過程包括識別、切除、修復及接合。參與 NER 的蛋白眾多，其中促成順鉑耐受的關(guān)鍵因子包括切除修復交叉互補基因 1 ( excision repair cross-complementation group 1，ERCC1 )、著色性干皮病基因 F [ xeroderma pigmentosum( XP ) complementation group F，XPF ]、XPD 及 XPG。ERCC1 與 XPF 形成異源二聚體在 5' 端切除 DNA 損傷，研究顯示 ERCC1 的 SNP 與骨肉瘤患者的無瘤生存時間有關(guān)[22]，且 ERCC1 表達越高，患者無瘤生存期與總生存期越短[23]；在骨肉瘤細胞中用 shRNA 沉默 XPF 后，順鉑對細胞的殺傷效力顯著提高[24]。XPD 與 XPG 也參與損傷 DNA 的切除，骨肉瘤中二者的 SNP 也與患者的無瘤生存期相關(guān)[25]；且抑制 XPG 表達后，骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性增加[24]。錯配修復 ( mismatch repair，MMR ) 是在DNA 復制或重組過程中糾正錯配堿基的方式，也是修復DNA 鏈內(nèi)損傷的一種方式，在骨肉瘤中，參與 MMR 的蛋白 MSH2 和 MSH6 高表達與化療不敏感相關(guān)[26]。另外，同源重組 ( homologous recombination，HR ) 能修復順鉑造成的鏈間交聯(lián)損傷，RAD51 蛋白參與 HR 途徑，研究顯示干擾 RAD51 能夠提高順鉑對骨肉瘤細胞的毒性作用[27]；新近發(fā)現(xiàn)范科尼貧血 ( fanconi anemia，F(xiàn)A ) 通路也能介導HR 修復，該通路被抑制后，骨肉瘤對順鉑的敏感性也增加[28]。除了修復能力增強，對 DNA 損傷的耐受也能使細胞抵抗順鉑?？鐡p傷 DNA 合成 ( translesion DNA synthesis，TLS ) 是一種重要的 DNA 損傷耐受方式，它可以利用低保真性的聚合酶使細胞在 DNA 損傷存在的情況下，依然能夠繼續(xù)復制 DNA。在骨肉瘤細胞中，削弱 TLS途徑也能增強順鉑的殺傷效應[28]。

四、凋亡信號通路減弱

誘導細胞凋亡是順鉑-DNA 交聯(lián)物發(fā)揮細胞毒性的主要方式。所以，凋亡相關(guān)通路信號的抑制或缺失將會減弱順鉑的細胞毒性作用。參與凋亡的通路及蛋白多樣，如磷脂酰肌醇 3-激酶 / 絲氨酸或蘇氨酸激酶 ( PI3K / Akt )通路、p38 絲裂原活化蛋白激酶 ( mitogen-activated protein kinase，MAPK ) 通路、腫瘤抑制因子 p53 及抗凋亡蛋白等。腫瘤中 PI3K / Akt 通路能影響凋亡、增殖、分化等多方面表型，研究證實該通路的異常激活參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展[29]，同時，PI3K / Akt 通路也介導骨肉瘤耐受順鉑，抑制該通路能顯著增強細胞對順鉑的敏感性[30-31]。作為MAPK 超家族的一員，p38 MAPK 通路是順鉑誘導的主要凋亡相關(guān)通路之一，該通路的抑制能夠使腫瘤耐受順鉑[32]。在骨肉瘤中，已經(jīng)證實外源激活 p38 MAPK 通路具有對順鉑增敏的效果[33]。p53 在藥物誘導細胞凋亡發(fā)生過程中十分重要，但腫瘤中 p53 基因多發(fā)生突變，骨肉瘤中 p53 突變率高達 31%～82%，且大部分為功能喪失性突變[1]；在耐藥的骨肉瘤細胞系中，導入 p53 基因能顯著提高細胞對順鉑的敏感性[34]?？沟蛲龅鞍妆磉_增加能抑制凋亡的發(fā)生，B 淋巴細胞瘤-2 ( B-cell lymphoma-2，Bcl-2 ) 蛋白家族是直接參與調(diào)控內(nèi)源性凋亡通路的關(guān)鍵蛋白，Bcl-2 及Bcl-xL 蛋白表達下調(diào)是啟動內(nèi)源性凋亡通路的關(guān)鍵信號。在化療耐受的腫瘤中，Bcl-2 普遍高表達[35]。在骨肉瘤中，Bcl-2 及 Bcl-xL 表達上調(diào)也使細胞耐受順鉑[36-37]。

五、自噬相關(guān)耐藥

自噬是自噬體與溶酶體共同介導的物質(zhì)降解過程，包括啟動、囊泡成核、囊泡延伸、囊泡封閉、囊泡成熟、與溶酶體融合 6 個階段。雖然自噬與凋亡的關(guān)系存在爭議，但越來越多證據(jù)顯示自噬能幫助腫瘤細胞抵抗化療藥物引起的凋亡，使其獲得耐藥性[38]。Jiang 等[39]發(fā)現(xiàn)耐受順鉑的骨肉瘤細胞的自噬水平顯著升高。蛋白激酶 ULK1 復合物是自噬體形成的起點，正常情況下，ULK1 及 ATG13( ULK1 復合物的組成部分 ) 被哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 C1( mTORC1 ) 磷酸化而處于非活性態(tài)；饑餓時，mTORCT1去磷酸化，ULK1 得以活化，進而啟動后續(xù)自噬過程。研究顯示在骨肉瘤細胞中，順鉑能激活 SRC 激酶-AMP 依賴的蛋白激酶 ( AMPK ) 信號通路，活化的 AMPK 通路抑制 mTOR，從而誘導自噬；氯喹可以抑制自噬體與溶酶體的融合，體內(nèi)成瘤實驗顯示氯喹與順鉑聯(lián)合相對于順鉑單藥，抗骨肉瘤效果明顯增強[40]。III 型 PI3K ( PI3KC3 )-自噬相關(guān)蛋白 Beclin1 復合物參與囊泡成核。在骨肉瘤細胞中，順鉑通過上調(diào)高遷移率族蛋白 1 ( high mobility group box 1，HMGB1 ) 來促進 PI3KC3-Beclin1 復合體的形成，誘導自噬相關(guān)耐受[41]。

六、非編碼 RNA 相關(guān)耐藥

微小 RNA ( microRNA，miRNA ) 是一類長度通常為18～25 個核苷酸的單鏈非編碼 RNA，它在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因 mRNA，從而發(fā)揮相應作用。通過對比分析腫瘤 / 瘤旁組織或順鉑敏感 / 不敏感組織及細胞的 miRNA表達譜發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤中的以下改變均促進對順鉑的耐受：miRNA-221[42]及 miRNA-33a[43]表達上升；miRNA-497[44]、 miRNA-138[45]、 miRNA-199a[46]、 miRNA-223[47]、miRNA-20a[48]、miRNA-22[49]、miRNA-34c[50]、miRNA-491[51]及 miRNA-340-5p[52]表達下降。長鏈非編碼 RNA ( long non-coding RNA，lncRNA ) 是長度＞200 個核苷酸的非編碼 RNA，它能在基因、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后多個水平影響腫瘤的生物學行為。骨肉瘤中高表達的 lncRNA HOTTIP 激活 Wnt / β-catenin 通路，高表達的 lncRNA NEAT1 抑制 miRNA-34c，削弱順鉑的殺傷效應[53-54]。lncRNA LINC00161 能通過上調(diào)干擾素誘導基因 2 ( IFIT2 )的表達來增強順鉑誘導凋亡的能力，在耐受順鉑的骨肉瘤細胞中，LINC00161 呈低表達[55]。與 miRNA 及 lncRNA 這些線性 RNA 不同，環(huán)狀 RNA ( circular RNA，circRNA ) 呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，近年研究顯示 circRNA 如 circPVT1[56]和circ_001569[57]也參與促進骨肉瘤耐受順鉑。

七、腫瘤微環(huán)境相關(guān)耐藥

腫瘤微環(huán)境指腫瘤細胞生長的局部條件特征，包括細胞成分如免疫細胞及纖維細胞等及理化因素如溫度、pH值等。研究發(fā)現(xiàn)，在 42 ℃ 及 43 ℃，順鉑 ( 5 μg / ml ) 殺死骨肉瘤細胞的效率相對 37 ℃，分別提高 0.9 及 1.6 倍[58]。腫瘤局部的壓力變化也能影響細胞對順鉑的反應，Nathan等將腫瘤切除術(shù)中監(jiān)測到的腫瘤組織液壓與 12 例骨肉瘤患者對包含順鉑在內(nèi)的化療方案的反應好壞進行相關(guān)性分析顯示，好的預后與高的腫瘤組織液壓呈正相關(guān)；進一步細胞實驗提示高壓環(huán)境下，腫瘤增殖能力更強，從而對順鉑的反應更敏感[59]。另外，有研究發(fā)現(xiàn) pH 降低時 ( pH＝6.5 )，骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性也隨之降低[60]。實體瘤內(nèi)部通常呈現(xiàn)低氧狀態(tài)，大量證據(jù)表明低氧促進對化療的耐受[61]。低氧同樣促進骨肉瘤耐受順鉑，然而，與其它多數(shù)類型腫瘤不同，骨肉瘤中低氧介導的順鉑耐受是通過激活 PI3K / Akt 通路實現(xiàn)的，而不是抑制低氧誘導因子 1( hypoxia inducible factor-1，HIF-1 ) 的表達[62-63]。

八、腫瘤干細胞相關(guān)耐藥

腫瘤干細胞學說認為腫瘤起源于一小團具有自我復制及分化能力的惡性細胞，即腫瘤干細胞。腫瘤干細胞構(gòu)成整個腫瘤組織的一小部分，其相對于已分化的腫瘤細胞更加耐受化療[64]。從骨肉瘤細胞系中培育出的具有腫瘤干性特征的細胞對順鉑更加抵抗[65]。Notch 信號通路是維持腫瘤干細胞特征的關(guān)鍵因素[64]，Notch 通路抑制劑 DAPT 能減弱耐受順鉑的骨肉瘤細胞系的干性特征，并增加它們對順鉑的敏感性[66]。但骨肉瘤干細胞獲得順鉑抵抗的機制尚不清楚。Shang 等[67]檢測到 M2 型丙酮酸激酶 ( pyruvate kinase isoenzyme M2，PKM2 ) 在骨肉瘤干細胞中表達上調(diào)，PKM2 能促進三磷酸腺苷 ( ATP ) 的產(chǎn)生，提示能量供應的增加可能與耐藥產(chǎn)生有關(guān)。

九、其它

失巢凋亡 ( anoikis ) 是細胞脫離其貼附的基質(zhì)后發(fā)生的程序性死亡，能防止細胞在不適宜的地方種植并生長。腫瘤細胞能通過某些途徑抵抗失巢凋亡，發(fā)生轉(zhuǎn)移與擴散。骨肉瘤細胞獲得抵抗失巢凋亡的能力后，對順鉑的耐受能力也增強了 1～6 倍[68]，提示二者可能具有一定關(guān)系。除了直接擴散，細胞也能分泌外泌體與鄰近或遠處細胞溝通。外泌體是 50～100 nm 大小的微囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA 及豐富的 miRNA 等。在神經(jīng)母細胞瘤、肺癌及胃癌中，外泌體通過運輸特定 miRNA 使細胞耐受順鉑[69-71]。如前所述，多種 miRNA 能介導骨肉瘤耐受順鉑，那么在骨肉瘤中，外泌體是否參與傳遞相應miRNA 的信息，從而促進順鉑耐受，值得進一步探究。

骨肉瘤的預后取得長足改善始于化療藥物的應用。而今多藥耐藥局面的出現(xiàn)，為臨床治療骨肉瘤提出巨大的挑戰(zhàn)。骨肉瘤耐受順鉑的機制多樣且復雜，目前已經(jīng)有一些研究針對這些耐藥機制來嘗試克服對順鉑的耐受，包括抑制細胞解毒能力[21]、抑制 DNA 損傷修復[28]、多藥聯(lián)合增強凋亡通路信號[33]等。需要注意的是，這些耐藥機制往往不是單一發(fā)揮作用，而是多途徑共同影響順鉑敏感性，這給降低骨肉瘤對順鉑耐受的探索帶來困難。近年來，免疫療法成為腫瘤治療的熱點，但骨肉瘤中的臨床試驗效果都不令人滿意[72-73]。所以，對包括順鉑在內(nèi)的經(jīng)典化療藥物的耐受研究依然任重道遠。相信隨著對順鉑耐藥機制理解的深入與透徹，將會產(chǎn)生有力可靠的逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的方法，為骨肉瘤的治療帶來新的希望。