王瑩慧，孫萌萌，汪育文，吳 敏，陳國祥

(南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210023)

劍葉全展后雜交水稻籽粒灌漿所需干物質(zhì)的60%以上來自葉片的光合作用[1]，但雜交水稻在生育后期存在若干限制性因素，比如功能葉片提前衰老,葉綠體加速降解,光合能力顯著降低等，這在一定程度上影響著雜交水稻干物質(zhì)的積累。因此，深入探究雜交水稻劍葉衰老機制，利用生物技術手段延緩或控制葉片早衰，增強作物在灌漿充實期“源”的積累，改善籽粒充實度，這將對雜交水稻高產(chǎn)潛力的充分發(fā)揮具有重要意義[2]。

在水稻葉片衰老研究領域，近些年已經(jīng)取得了重要進展，但多數(shù)研究僅從水稻衰老生理或光合性狀等方面開展，從分子生物學層面精準揭示水稻葉片衰老機理的研究并不多見[1,3-4]。隨著分子生物學的迅速發(fā)展，越來越多的研究者試圖從分子水平上探究植物葉片衰老的機制[1,5-7]。本研究借助蛋白質(zhì)組學分析手段，以超高產(chǎn)雜交水稻兩優(yōu)培九為研究材料，探究水稻劍葉發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)表達差異性，從蛋白質(zhì)水平闡明水稻葉片發(fā)育以及衰老的機理，以期為揭示雜交水稻衰老的分子機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料種植

雜交水稻兩優(yōu)培九于2013年5月中旬種植于南京師范大學仙林校區(qū)植物園，常規(guī)施肥管理，及時防治病蟲害。于8月15日和9月25日，取孕穗期和乳熟期這2個生殖生長關鍵時期的水稻劍葉進行蛋白質(zhì)組學分析。

1.2 葉綠素含量的測定

參照Arnon[8]的方法測定劍葉葉綠素含量。

1.3 蛋白質(zhì)組學分析

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取與濃度測定 采用三氯乙酸-丙酮沉淀法提取水稻劍葉蛋白質(zhì)。稱取1.0 g葉片，加液氮充分研磨成粉末，加入10 ml預冷的三氯乙酸沉淀液(含10.00%三氯乙酸、0.07%巰基乙醇的丙酮溶液)充分混合，-20 ℃放置l h，4 ℃、15 000g離心15 min，取沉淀。加入l0 ml樣品洗滌液(含0.07%巰基乙醇的丙酮溶液)懸浮振蕩沉淀，-20 ℃靜置1 h，4 ℃、15 000g離心15 min，取沉淀并真空干燥成粉末狀。以20 ml/g比率加入蛋白質(zhì)溶解液[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脈、4.0% 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、1% 二硫蘇糖醇(DTT)、0.5%固相pH梯度膠條緩沖液(IPG Buffer pH 4～7，GE Healthcare)溶解樣品粉末，振蕩混勻，37 ℃溫浴l h，室溫下15 000g離心l0 min，上清液即為蛋白質(zhì)提取液。運用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白(BSA)(Bio-Rad公司產(chǎn)品)作為蛋白質(zhì)標準品。

1.3.2 等電聚焦電泳 用pH 3～10、長24 cm的IPG膠條(Bio-Rad公司產(chǎn)品)進行第一向等電聚焦，每個樣品均獨立重復3次，每次蛋白質(zhì)上樣量為150 μg。聚焦程序為：20 ℃被動水化12 h，250 V線性聚焦30 min，1 000 V快速聚焦1 h，10 000 V線性聚焦5 h，10 000 V 快速聚焦8 h，500 V快速聚焦10 h。等電聚焦完成后，IPG膠條分別在平衡液I [0.375 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)、6.000 mol/L尿素、20.0%甘油、2.0% SDS、2.0% DTT]和平衡液II [0.375 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)、6.000 mol/L尿素、20.0%甘油、2.0% SDS、2.5%碘乙酰胺]中平衡15 min。在室溫下進行12% SDS-PAGE、600 V恒壓電泳分離，凝膠用參照Chevallet等[9]的方法進行銀染。

1.3.3 凝膠圖像處理 用Epson Expression 11000XL掃描儀掃描凝膠，通過PDQuest v7.4(Bio-Rad)軟件分析孕穗期和乳熟期蛋白質(zhì)表達譜的差異，以及差異蛋白質(zhì)的名稱、分子量和等電點。在3次重復中均出現(xiàn)，且豐度變化≥2倍，同時t檢驗滿足P<0.05的蛋白質(zhì)點作為差異蛋白質(zhì)點。

1.3.4 膠內(nèi)酶解 挖取差異蛋白質(zhì)凝膠置于96孔板中，加入ddH2O超聲波清洗5～10 min，加50 μl乙腈脫水至膠粒徹底變白，真空抽干5 min，加入50 μl處理液I [10 mmol/L DTT、25 mmol/L NH4HCO3]，56 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，吸干，迅速加入50 μl處理液II [55 mmol/L碘乙酰胺、25 mmol/L NH4HCO3]，25 ℃避光45 min，加入25 mmol/L NH4HCO3、50%乙腈洗脫，至膠粒完全變白，真空抽干5 min，每孔加2～3 μl 10 ng/μl胰蛋白酶液(用25 mmol/L NH4HCO3配制)，4 ℃靜置30 min，吸去剩余酶液，加入10～15 μl 25 mmol/L NH4HCO3覆蓋膠粒，37 ℃溫浴，過夜(10～14 h)，加0.1%三氟乙酸(TFA)以終止酶解反應，振蕩離心，用于質(zhì)譜分析。

1.3.5 質(zhì)譜分析 使用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析儀(MALDI-TOF/TOF，型號Ultraflex II)進行肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprint，PMF)鑒定。所得PMF圖譜用Flexanalysis 3.0軟件處理，肽段檢測算法為SNAP算法，信噪比(S/N)、質(zhì)量因子的域值分別為1.5和50.0，用胰蛋白酶(Porcine trypsin)的自解片段(Trypsin，m/z=842.509 4、2 211.104)作為內(nèi)參校準。用Matrixscience網(wǎng)站的站內(nèi)Mascot查找系統(tǒng)對肽質(zhì)量指紋譜進行數(shù)據(jù)庫檢索(http://www.matrixscience.com)。檢索要求：誤差允許范圍(Mass tolerance) 0.01%，可以有1個氨基酸的誤切(Miss cleavage)，修飾包括半胱氨酸的甲?；?Carbamidomethyl)和甲硫氨酸的氧化(Methionine oxidation)，實驗和理論肽質(zhì)量指紋譜匹配的肽段至少有5個。

1.3.6 生物信息學分析 通過UniProtKB (http://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫對鑒定的差異蛋白質(zhì)進行分子功能和細胞定位分析。將鑒定的差異蛋白質(zhì)通過UniProtKB的Blast功能搜索定位到相應的擬南芥同源基因，并使用GeneMania (http://genemania.org)進行蛋白質(zhì)網(wǎng)絡互作預測。

2 結果與分析

2.1 雜交水稻兩優(yōu)培九劍葉衰老過程中葉綠素含量的變化

葉綠素作為吸收和傳遞光能的主要功能載體，在葉片衰老過程中逐漸被降解，葉色變黃。兩優(yōu)培九劍葉全展后，葉綠素總含量和葉綠素a/b值均呈現(xiàn)出逐漸下降趨勢且下降幅度顯著(圖1)。由此可見，水稻劍葉全展后葉片逐漸進入衰老狀態(tài)。

圖1 雜交水稻兩優(yōu)培九劍葉全展后葉綠素含量變化Fig.1 Changes of chlorophy II content of flag leaves of hybrid rice Liangyoupeijiu during days after full expansion

2.2 雜交水稻兩優(yōu)培九劍葉衰老過程中蛋白質(zhì)表達譜的變化

在3張重復試驗的等電聚焦電泳凝膠上都可以檢測到超過1 000個清晰的蛋白質(zhì)點(圖2)。對孕穗期和乳熟期2個時期的凝膠圖像進行對比和解析，共發(fā)現(xiàn)78個蛋白質(zhì)點表達譜存在差異。與孕穗期(劍葉全展后7 d)相比，乳熟期(劍葉全展后28 d)有21個蛋白質(zhì)點表達量增加，57個蛋白質(zhì)點表達量下降。

2.3 雜交水稻兩優(yōu)培九劍葉衰老過程中差異表達蛋白質(zhì)的鑒定和功能分類

經(jīng)過MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜分析，乳熟期劍葉中78個差異表達蛋白質(zhì)點中53個被成功鑒定，這53個蛋白質(zhì)點的詳細信息列于表1。從表1中發(fā)現(xiàn)存在多個蛋白質(zhì)點鑒定為同一蛋白質(zhì)的情況，比如核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶激酶(蛋白質(zhì)點1 132和1 166)，核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶激酶活化酶(蛋白質(zhì)點976和1 101)，核糖體蛋白(蛋白質(zhì)點1 156和1 136)。在其他研究中也有類似的現(xiàn)象[10]。這可能是由蛋白質(zhì)的降解或者甲基化、磷酸化修飾等原因造成。根據(jù)UniProtKB (http://www.uniprot.org/uniprot/)網(wǎng)站上每個蛋白質(zhì)的注釋及其參與的生化途徑進行功能分類和亞細胞定位分類[11]。按照其功能，這些蛋白質(zhì)被歸于8類：光合作用(Photosynthesis)18.9%，能量代謝(Eenergy metabolism)3.8%，蛋白質(zhì)代謝(Protein metabolism)15.1%，脂質(zhì)代謝(Lipid metabolism)3.8%，碳水化合物及氨基酸代謝(Carbohydrate and amino acid metabolism)3.8%，信號轉導(Signal transduction)7.5%，脅迫響應(Stress response)11.3%，未知功能(Unknown function)35.8% (圖3-A)。通過亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)分別位于葉綠體、線粒體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、液泡、細胞質(zhì)、細胞核和細胞膜上，但是有32.1%的蛋白質(zhì)在細胞中的具體位置和分布尚不清楚，除此之外位于葉綠體中的蛋白質(zhì)數(shù)目最多，占30.2% (圖3-B)。

A：孕穗期(劍葉全展后7 d)；B：乳熟期(劍葉全展后28 d)。圖2 雜交水稻兩優(yōu)培九生殖生長關鍵時期劍葉蛋白質(zhì)雙向電泳圖Fig.2 The two-dimensional electrophoresis protein maps of flag leaves of hybrid rice Liangyoupeijiu during the critical periods of reproductive growth

2.4 雜交水稻兩優(yōu)培九劍葉衰老過程中差異蛋白質(zhì)的表達變化

2.4.1 光合相關蛋白質(zhì)的表達變化 通過蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，乳熟期劍葉中與光合作用相關的蛋白質(zhì)整體表達下降(表1)。光反應相關蛋白質(zhì)CP23蛋白(Chloroplast 2.3×104polypeptide of photosystem II)、放氧復合體蛋白1(Oxygen-evolving complex protein1)、鐵氧化還原蛋白-NADP(H)氧化還原酶(Putative ferredoxin-NADP(H) oxidoreductase)、ATP合酶CF1β亞基(ATP synthase CF1 beta subunit，ATPB)和atpB基因編碼產(chǎn)物(atpBgene product)的表達下調(diào)，碳固定與轉化的相關蛋白質(zhì)RuBisCO酶大小亞基及其前體和RuBisCO活化酶及其小同工型前體的表達也呈現(xiàn)下降趨勢。

2.4.2 代謝相關蛋白質(zhì)的表達變化 植物的生長發(fā)育過程伴隨著氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì)的代謝。乳熟期劍葉中與細胞代謝相關的蛋白質(zhì)胼胝質(zhì)合成酶(GSL11)、半胱氨酸合成酶(OASA1)、甘油-3-磷酸乙酰轉移酶(GPAT3)表達下調(diào)，同時光合相關蛋白質(zhì)表達也下降，說明葉片衰老過程中蛋白質(zhì)合成受阻。此外，核蛋白質(zhì)合成的60S、40S、質(zhì)體及線粒體蛋白質(zhì)合成的30S和50S相關蛋白質(zhì)表達量降低，例如核糖體蛋白S19(Ribosomal protein S19)、核糖體蛋白L1家族蛋白(Ribosomal protein L1 family protein)、核糖體蛋白S3(Ribosomal protein S3) 和糖基化修飾相關的N-糖胺酰轉移酶(CGL1) 表達量也下降，而蛋白質(zhì)轉運相關的Ras蛋白(RABA5C)及脂質(zhì)轉運有關的磷脂轉運ATP酶2(ALA2)含量上升。

2.4.3 信號轉導及脅迫響應相關蛋白質(zhì)的表達變化 植物葉片衰老過程中，細胞與細胞器的結構與功能發(fā)生一系列改變，包括丙二醛和活性氧的產(chǎn)生，葉綠體類囊體膜完整性的破壞，膜脂過氧化嚴重等。為了抵御過氧化造成的損傷，植物大量表達與逆境脅迫、防御相關的蛋白質(zhì)。本研究中，乳熟期劍葉中過氧化物酶21和轉錄因子類似R2R3MYB結構域蛋白(Similar to R2R3MYB-domain protein) 表達量都表現(xiàn)出上升的趨勢，但與脅迫響應相關的Harpin蛋白結合蛋白1(Harpin binding protein 1)、葉綠體4.1×104RNA莖環(huán)結合蛋白b(Chloroplast stem-loop binding protein of 4.1×104b)和 S受體激酶PK3前體樣蛋白(S-receptor kinase PK3)出現(xiàn)表達量下降趨勢。在信號轉導通路蛋白質(zhì)方面，形成素樣蛋白5(Formin protein5)和Shaggy相關的蛋白激酶κ也出現(xiàn)表達下調(diào)。

表1通過質(zhì)譜分析鑒定的53個水稻劍葉差異表達蛋白質(zhì)的具體信息

Table1Detailedinformationofthefifty-threedifferentlyexpressedproteinsofriceflagleavesidentifiedbymassspectrometry

功能 點號蛋白質(zhì)含量變化登陸號等電點分子量(×103)得分匹配數(shù)覆蓋率(%)蛋白質(zhì)名稱亞細胞定位同源基因光合作用相關蛋白質(zhì)163上調(diào)gi|1643755435.5620.02861568葉綠體光系統(tǒng)II 2.3×104蛋白質(zhì)葉綠體At1g06680 (PSBP)439下調(diào)gi|1493927255.1030.59921647二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活化酶葉綠體At2g39730 (RCA)544下調(diào)gi|7392925.1026.508517 45放氧復合體蛋白1葉綠體At5g66570 (PSBO)976下調(diào)gi|135696434.7821.74811251二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活化酶葉綠體At2g39730 (RCA)1001下調(diào)gi|627332975.5952.391222646RuBisCO活化酶小同工型前體葉綠體At2g39730 (RCA)1125下調(diào)gi|410529157.9841.09421023假定的鐵氧化還原蛋白- NADP(H)氧化還原酶葉綠體At1g20020 (LFNR2)1132下調(diào)gi|3122046666.074.91931467二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基葉綠體AtCg00490 (rbcL)1166下調(diào)gi|1102889458.5140.76841329二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶長鏈前體葉綠體AtCg00490 (rbcL)1174下調(diào)gi|5528575.3053.95401232atpB基因編碼產(chǎn)物(葉綠體)葉綠體AtCg00480 (atpB)1196下調(diào)gi|114667945.4754.031182542ATP合酶CF1的β亞基葉綠體AtCg00480 (atpB)能量代謝相關蛋白質(zhì)996下調(diào)gi|1255643215.3540.35621021假定蛋白OsI_31986(丙酮酸脫氫酶E1的β亞基,線粒體)線粒體At5g50850 (MAB1)1223下調(diào)gi|1154549435.8682.14591620線粒體的NADH-泛醌氧化還原酶7.5×104亞基前體線粒體At5g37510 (EMB1467)蛋白質(zhì)代謝相關蛋白質(zhì)89上調(diào)gi|121360110.2810.6554862核糖體蛋白S19, 部分(葉綠體)葉綠體ATCG00820 (rps19)109上調(diào)gi|2226408955.9744.53451121假定蛋白OsJ_28001(Ras相關蛋白RABA5c)高爾基體At2g43130 (ARA-4)264上調(diào)gi|1256009378.4416.8044636假定蛋白OsJ_24969質(zhì)膜At3g09770 (LOG2)1027下調(diào)gi|2975979949.9010.5146759核糖體蛋白L1家族蛋白細胞質(zhì)At1g14320 (RPL10A)1111下調(diào)gi|2976078866.579.3541441Os08g0113300蛋白細胞質(zhì)At3g07370 (CHIP)1120下調(diào)gi|1255253226.2448.93431223假定蛋白OsI_01316(SAD1/UNC-84結構域蛋白1)細胞核At5g04990 (SUN1)1143下調(diào)gi|2181918835.8639.14421127假定蛋白OsI_09579(N-糖酰胺轉移酶)高爾基體At4g38240 (CGL1)1156下調(diào)gi|22392740410.0017.5033426核糖體蛋白S3葉綠體AtCg00800 (rps3)1178下調(diào)gi|2975979949.9010.5146759核糖體蛋白L1家族蛋白細胞質(zhì)At1g14320 (RPL10A)脂質(zhì)代謝相關蛋白質(zhì)29上調(diào)gi|1256047504.9918.9847735假定蛋白OsJ_28405(磷脂轉運ATP酶2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)At5g44240 (ALA2)1084下調(diào)gi|1255252118.8360.6352117假定蛋白OsI_01201(可能的甘油-3-磷酸?；D移酶)葉綠體/線粒體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)At4g01950 (G3PAT)碳水化合物及氨基酸代謝相關蛋白質(zhì)1088下調(diào)gi|537918195.2737.3651816假定的半胱氨酸合酶細胞質(zhì)At4g14880 (OASA1)1126下調(diào)gi|6704415729.581.4635542假定胼胝質(zhì)合酶6質(zhì)膜At3g59100 (GSL11)

續(xù)表1Continued1

功能點號蛋白質(zhì)含量變化登陸號等電點分子量(×103)得分匹配數(shù)覆蓋率(%) 蛋白質(zhì)名稱亞細胞定位同源基因信號轉導相關蛋白質(zhì)1上調(diào)gi|1255968766.2615.2936955假定蛋白OsJ_21000(胚胎形成跨膜樣蛋白)質(zhì)膜-942下調(diào)gi|29772740510.1740.6936923Os10g0205900蛋白(形成素樣蛋白5)質(zhì)膜At1g26150 (PERK10)1096下調(diào)gi|6580611957.1128.83811138預測的類shaggy相關的蛋白激酶κ質(zhì)膜At1g09840 (ASK10)脅迫響應相關蛋白質(zhì)4上調(diào)gi|2537620146.7230.04451030過氧化物酶21過氧化物酶體At1g0525017上調(diào)gi|1154891068.769.3736323類似R2R3MYB結構域蛋白細胞核At3g06490 (MYB108)24上調(diào)gi|507262617.019.21421211有機陽離子轉運體樣蛋白液泡膜At3g20660 (OCT4)1078下調(diào)gi|2190206111.5826.8238620S受體激酶PK3前體樣蛋白質(zhì)膜At1g11350 (SD113)1127下調(diào)gi|1154883408.5941.6272916Os12g0420200蛋白(葉綠體的41 kDa RNA莖環(huán)結合蛋白b)葉綠體At1g09340 (CRB)1176下調(diào)gi|386793258.9228.3649420harpin結合蛋白1葉綠體At3g23400 (FIB4)未知功能蛋白質(zhì)5上調(diào)gi|515359076.399.6551755假定蛋白--16上調(diào)gi|12557236711.2010.8447864假定蛋白OsJ_03809--21上調(diào)gi|507256618.656.0756574假定蛋白--66上調(diào)gi|2977222514.4412.7137534Os03g0438400蛋白--71上調(diào)gi|5072551811.948.3447439假定蛋白--82上調(diào)gi|2181906195.1612.5645850假定蛋白OsI_06993--102上調(diào)gi|29772228512.085.7644566Os03g0573750蛋白質(zhì)膜AT2G19350983下調(diào)gi|2586447299.4325.4439517假定蛋白--997下調(diào)gi|2181864716.0510.5238771假定蛋白OsI_37558--1079下調(diào)gi|903993265.1311.9833753H0313F03.10蛋白--1080下調(diào)gi|493878359.9520.1737832假定蛋白--1091下調(diào)gi|3863714610.5020.7245938假定蛋白--1092下調(diào)gi|199201149.4068.03491518假定的逆轉錄因子細胞核-1097下調(diào)gi|11631098811.4625.8941626OSIGBa0138E08-OSIG-Ba0161L23.4蛋白--1109下調(diào)gi|29772134910.1911.8754437Os02g0580800蛋白--1134下調(diào)gi|21819800711.1515.7348528假定蛋白OsI_22617--1137下調(diào)gi|627330346.818.1547659假定蛋白LOC_Os11g14690--1148下調(diào)gi|29772134910.1911.8744437Os02g0580800蛋白--1149下調(diào)gi|1255773715.1911.8845870假定蛋白OsJ_34120--

登陸號、得分、匹配數(shù)和覆蓋率通過Mascot軟件從NCBInr、Swiss Prot和EST數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析獲得。覆蓋率：蛋白質(zhì)氨基酸序列被匹配的肽段所覆蓋的百分比；得分：肽段分子質(zhì)量計算得分；匹配數(shù)：肽段氨基酸序列匹配數(shù)； -：未知。

圖3 鑒定的53個水稻劍葉差異表達蛋白質(zhì)的功能分類(A)和亞細胞定位(B)Fig.3 Functional classification and distribution (A) and protein subcellular locations (B) of all 53 identified differently expressed proteins of rice flag leaves

2.5 雜交水稻兩優(yōu)培九劍葉衰老過程中差異蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡分析

通過UniProtKB的Blast分析，我們得到了34個已鑒定蛋白質(zhì)的擬南芥同源基因(表1)。利用GeneMANIA 對這些同源基因進行蛋白質(zhì)互作預測，以尋找在孕穗期和乳熟期水稻葉片中蛋白質(zhì)網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析結果(圖4)顯示，圍繞光合作用的蛋白質(zhì)，例如RuBisCO大亞基(RBCL)、RuBisCO活化酶(RCA)、ATP合酶CF1β亞基(ATPB)、捕光復合體蛋白(LHC)等核心蛋白質(zhì)形成了1個大的功能群，涵蓋了所有7個已知功能分類的21個蛋白質(zhì)。甘油-3-磷酸乙酰轉移酶(GPAT3)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPA1)和光系統(tǒng)IG亞基(PSAG)存在相互作用。磷脂轉運ATP酶2(ALA2)與ATP合酶β亞基(ATPB)存在相互聯(lián)系。半胱氨酸合成酶(OASA1)和線粒體NADH-輔酶Q脫氫酶(EMB1467)、丙酮酸脫氫酶(PDH2)存在相互作用，且與光系統(tǒng)I葉綠素a-b結合蛋白(LHCA1、LHCA3)、PSII捕光復合物(LHCB4.1、LHCB5)、PSII放氧復合物I(PSBO1)、PSI F亞基(PSAF)共表達。

圖4 水稻孕穗期和乳熟期劍葉差異表達蛋白質(zhì)(擬南芥同源蛋白質(zhì))的互作網(wǎng)絡Fig.4 Interaction network of differentially expressed proteins (homologous proteins in Arabidopsis thaliana) in rice flag leaves during booting stage and milk stage

3 討 論

葉片衰老是一個精密調(diào)節(jié)、規(guī)范有序、具有策略的生理活動過程[12-14]，最顯著的特點是受到衰老調(diào)控的蛋白質(zhì)和基因表達量的連續(xù)微小的變化[15-19]。本研究采用雙向電泳技術對高產(chǎn)雜交水稻兩優(yōu)培九衰老進程中劍葉蛋白質(zhì)表達進行了分析，結果表明孕穗期與乳熟期劍葉中差異表達的蛋白質(zhì)點涉及諸多代謝途徑，包括光合作用、能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸及碳水化合物代謝。

兩優(yōu)培九乳熟期劍葉衰老過程中，光合相關的蛋白質(zhì)表達量降低，這些蛋白質(zhì)涉及光反應各個途徑。在暗反應中，RuBisCO、RuBisCO前體和RuBisCO活化酶3個主要蛋白質(zhì)表達量發(fā)生變化。RuBisCO含量降低將削弱暗反應中CO2的濃縮與固定，進而不利于作物有機物的積累。RuBisCO活化酶為RuBisCO的伴侶分子，能夠調(diào)節(jié)其活性，其主要作用是通過移除RuBisCO活化位點上的抑制性糖類實現(xiàn)對RuBisCO的激活[20]。有研究結果表明，受某種因素影響，未活化的RuBisCO與RuBP(1,5-二磷酸核酮糖)緊密結合，形成RuBisCO-RuBP復合物，使RuBisCO鈍化，不能進行反應；在光下，RuBisCO活化酶水解ATP并使RuBisCO-RuBP復合物解離，RuBP被釋放；RuBisCO被氨甲酸化，與Mg2+形成三元復合物(RuBisCO-CO2-Mg2+，ECM)，ECM與RuBP結合即可啟動羧化反應[21]。RuBisCO活化酶含量和活性的減少將加速RuBisCO酶含量與活性的下降[22-23]。由此可以看出，RuBisCO和RuBisCO活化酶的表達是相互關聯(lián)的。這說明劍葉衰老時，光反應和暗反應過程的許多蛋白質(zhì)表達量均有變化。

在細胞代謝方面，兩優(yōu)培九乳熟期劍葉在衰老進程中，表現(xiàn)出氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì)的合成代謝下降，物質(zhì)轉運活躍的趨勢。核糖體蛋白在蛋白質(zhì)生物合成中發(fā)揮著重要作用，其在乳熟期劍葉中表達下調(diào)可能是RuBisCO大亞基和RuBisCO活化酶表達下調(diào)的原因之一。N-糖胺酰轉移酶(CGL1)是蛋白質(zhì)N型糖基化修飾的關鍵酶，N-糖胺酰轉移酶表達的下調(diào)可能對糖蛋白的含量有調(diào)控作用。起蛋白質(zhì)轉運作用的P型環(huán)狀核苷三磷酸水解酶超家族蛋白(ARA4)隨著劍葉衰老而上調(diào)[24]。此外，Keech等[25]證實擬南芥葉片的衰老進程伴隨著細胞微管系統(tǒng)的解體。本研究中連接細胞核骨架和細胞骨架的LINC復合體組分蛋白SAD1/UNC-84結構域蛋白表達量的下降表明細胞骨架結構系統(tǒng)的變化也是葉片衰老的重要標志。

半胱氨酸合成酶(OASA1)的功能是催化半胱氨酸的合成，而半胱氨酸是合成抗氧化劑谷胱甘肽的重要底物之一[26]。乳熟期劍葉中半胱氨酸合成酶(OASA1)的表達量下調(diào)，說明谷胱甘肽的合成逐漸減少。蛋白質(zhì)網(wǎng)絡分析結果顯示，OASA1和多個光合蛋白質(zhì)(LHCA1、LHCA3、PSBO1等)以及線粒體NADH-輔酶Q脫氫酶(EMB1467)、丙酮酸脫氫酶(PDH2)共表達，推測其在葉綠體和線粒體功能衰退方面存在一定影響。胼胝質(zhì)合成酶6(GSL11)通常參與細胞壁延伸，同時能夠抵抗環(huán)境脅迫和病原體侵染，其表達量的下調(diào)說明水稻植株在衰老過程中抵御逆境的能力逐步下降[26-28]，這可能也是兩優(yōu)培九在生殖生長后期衰老加速的原因之一。

甘油-3-磷酸乙酰轉移酶(GPAT3)是甘油磷脂合成步驟中第一步反應的關鍵酶，在甘油三脂(TG)和甘油磷脂(Phosphatidylchoine)的生物合成中扮演重要角色。乳熟期劍葉中GPAT3含量的減少從源頭上造成類囊體膜的減少，繼而導致葉片光合能力下降，推測葉綠體的衰老是膜-蛋白質(zhì)系統(tǒng)協(xié)同變化的結果。然而，磷脂轉運ATP酶含量上升則說明供給內(nèi)膜系統(tǒng)的磷脂可能增加，推測在葉片衰老進程中，作為膜系統(tǒng)主要構成組分的磷脂系統(tǒng)在不同細胞區(qū)域的周轉具有異質(zhì)性。值得注意的是，脂質(zhì)代謝與蛋白質(zhì)代謝類似，均呈現(xiàn)出合成受阻而轉運活躍的規(guī)律。

植物衰老進程中大分子物質(zhì)的分解代謝越旺盛，消耗的能量則越多，而線粒體作為主要的產(chǎn)能細胞器，需保持活性以滿足衰老過程中的能量需求，因此，與葉綠體不同，線粒體的衰老往往是滯后的[29]。本研究中，水稻劍葉線粒體中的NADH-輔酶Q脫氫酶和丙酮酸脫氫酶的表達量在乳熟期顯著下降，限制了糖酵解產(chǎn)生的NADH和丙酮酸進入線粒體再利用，說明在葉片衰老后期線粒體氧化磷酸化效率降低可能與分解代謝逐漸削弱有關。

R2R3MYB結構域蛋白是植物中廣泛存在且功能多樣的一類MYB蛋白質(zhì)，參與次生代謝調(diào)節(jié)，細胞形態(tài)建成，激素刺激和逆境脅迫響應，分生組織形成及細胞周期控制等諸多生物過程，R2R3MYB基因受各種逆境脅迫的誘導[30-32]。R2R3MYB在乳熟期表達量上升，我們推測水稻衰老進程中，MYB轉錄因子與序列為TAACTG的核心元件結合，激活多個功能基因發(fā)揮作用，延緩植物衰老[33-36]。此外，作為液泡離子轉運蛋白的重要類型之一，有機陽離子轉運樣蛋白(Organic cation transporter-like protein)的表達量增加表明其在水稻衰老進程中具有重要作用[37]。HrBP1是植物葉綠體內(nèi)產(chǎn)生的受體蛋白，能夠與病原菌侵染植株時產(chǎn)生的Harpin信號蛋白特異性結合，乳熟期劍葉中HrBP1蛋白表達的顯著下調(diào)可能導致葉綠體對活性氧的氧化壓力變得敏感，促進光系統(tǒng)蛋白的降解，加速葉綠體的衰老進程[38-39]。此外，先前的研究結果表明葉綠體RNA莖環(huán)結構結合蛋白b(Chloroplast stem-loop binding protein of 41kDa b，CRB/CSP41b)對葉綠體RNA的轉錄和翻譯有調(diào)控作用[40]。但近年來的研究結果顯示CSP41b也是一個與干旱、鹽漬等逆境響應相關的蛋白質(zhì)，可能與脫落酸(ABA)信號轉導有關[41-42]。本研究中，乳熟期劍葉CSP41b表達量的下調(diào)可能對葉綠體基因編碼蛋白質(zhì)有調(diào)控作用，且同葉綠體核糖體蛋白的翻譯水平調(diào)控一致，但其對葉片衰老的具體調(diào)控機制還需進一步研究。隨著生長發(fā)育進程，過氧化物酶表達量增加，推測過氧化物酶兼具兩方面效應：一是作為抗氧化物酶類，負責清理代謝產(chǎn)物H2O2自由基；二是過氧化物酶同時還有生成H2O2的功能[43-44]，可能在水稻劍葉衰老過程中促進H2O2生成，最后導致水稻細胞膜發(fā)生過氧化，結構完整性遭到破壞，表現(xiàn)為促進衰老的效應。因此，細胞氧化壓力的增加和抗氧化系統(tǒng)性能的逐步降低是葉片衰老進程的重要特征。