王曉瓊， 趙陽國， 張彥超， 王君鵬， 鄭冰冰， 陳乙平

(中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

隨著近年來海水養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，中國已成為世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，2014年海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到1 813萬t[1]。然而，海水養(yǎng)殖過程存在嚴(yán)重的自身污染，投喂殘餌、代謝產(chǎn)物及排泄物等向海洋環(huán)境輸出大量的營養(yǎng)負(fù)荷，造成養(yǎng)殖區(qū)水環(huán)境嚴(yán)重的富營養(yǎng)化。其中，養(yǎng)殖環(huán)境中的硫化物是伴隨著餌料殘?jiān)锝到?、氧氣過度消耗而產(chǎn)生的主要污染物之一[2]，由于其強(qiáng)烈的生物毒性，對養(yǎng)殖區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能造成了嚴(yán)重危害，已成為制約海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵問題。

硫化物的修復(fù)方法主要包括物理、化學(xué)及生物方法，其中物理方法如吹脫、曝氣及顆?；钚蕴课降萚3]，具有設(shè)備簡易、操作便捷的優(yōu)點(diǎn)，然而該方法存在效率低、不能持久且易反復(fù)等問題；化學(xué)控制如化學(xué)氧化法[4]及化學(xué)沉淀法[5]等，化學(xué)方法去除硫化物速度快，但治理費(fèi)用較高且易對環(huán)境造成二次污染。相對于物理化學(xué)方法，硫化物的生物控制技術(shù)具有費(fèi)用低、耗時(shí)短、無二次污染、不破壞生態(tài)平衡等優(yōu)點(diǎn)[6]，已成為硫化物污染治理及回用的重要方法。硫氧化菌(Sulfur-oxidizing bacteria, SOB)是一類可將硫化物氧化產(chǎn)生單質(zhì)硫，或?qū)钨|(zhì)硫進(jìn)一步氧化為硫酸鹽的微生物[7]，對環(huán)境中還原性硫化物具有很好的控制作用。然而，直接使用游離細(xì)菌存在大量弊端，如細(xì)菌易被流水沖走、微生物難以適應(yīng)實(shí)際環(huán)境等弊端嚴(yán)重限制了生物修復(fù)的應(yīng)用[8-11]。為解決上述問題，微生物固定化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

微生物固定化技術(shù)總體上分為載體吸附法、交聯(lián)法和包埋法三大類。其中，載體吸附法通過物理吸附、化學(xué)或離子結(jié)合的方式將微生物細(xì)胞吸附到載體表面，其成本較低、操作簡單、對細(xì)胞的活性影響較小，易于推廣應(yīng)用[12]。Skoronski等[13]利用石墨烯固定從Aspergillusoryzae提取的漆酶，研究發(fā)現(xiàn)固定后的漆酶對pH值及溫度耐受范圍增大；Vichuviwat等[14]分析了磚粒和沸石兩種載體對菌株ClostridiumbeijerinckiiTISTR 1461的固定效果，結(jié)果表明兩種固定化載體均提高了該菌株的丁醇產(chǎn)量。與其他載體相比，陶粒對微生物無毒，機(jī)械強(qiáng)度高，物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，使用壽命長且價(jià)格低廉，因此被作為合適的細(xì)胞固定化載體廣泛使用。龔浩等[15]利用陶粒作為濾料吸附去除水中的卡馬西平(CBZ)，當(dāng)進(jìn)水CBZ濃度為2 μg·L-1時(shí)，其最高去除率可達(dá)到40%；Zhou等[16]的研究表明以陶粒為載體的生物反應(yīng)器固定氨氧化細(xì)菌可取得良好的去除效果，硝酸根的去除率穩(wěn)定在90%左右；Rattanapan等[17]將2株硫氧化菌固定到陶粒上并應(yīng)用到生物濾池中，該系統(tǒng)表現(xiàn)出對硫化氫氣體較好的去除作用。國內(nèi)外對硫氧化菌固定化的研究和應(yīng)用主要集中在對生物反應(yīng)器中硫化氫氣體脫硫方面，應(yīng)用固定化硫氧化菌對海水養(yǎng)殖生境硫化物污染進(jìn)行控制的研究較少。

在此背景下，本研究以膠州灣養(yǎng)殖區(qū)分離得到的硫氧化菌株嗜熱氫弧菌(Hydrogenovibriothermophilus)TT為對象，利用陶粒和沸石作為固定化載體，考察不同載體固定條件對其去除還原性硫化物的影響，并通過對載體進(jìn)行改性進(jìn)一步提高其對菌體的吸附作用，從而為海水養(yǎng)殖環(huán)境中硫化物的生物控制提供基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株來源 實(shí)驗(yàn)采用的硫氧化菌株TT分離自膠州灣海水養(yǎng)殖區(qū)，經(jīng)16S rDNA序列測序比對鑒定該菌株為嗜熱氫弧菌(Hydrogenovibriothermophilus)。該菌株微需氧，可同時(shí)利用有機(jī)碳源和無機(jī)碳源，將還原性硫化物氧化成單質(zhì)硫和硫酸鹽。該菌在較寬泛的溫度和pH范圍內(nèi)都能生長，最優(yōu)生長條件為：溫度30～40℃、pH=7～9，能較好的適應(yīng)海水養(yǎng)殖環(huán)境。

1.1.2 培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基成分(g·L-1)：Na2S·9H2O 4.5，NaHCO32.0，K2HPO41.2，KH2PO41.2，NH4Cl 0.4，MgCl20.2，F(xiàn)eC6H5O70.01，經(jīng)0.45 μm孔徑濾膜過濾的陳海水進(jìn)行配制，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，配制完成后120 ℃高溫高壓滅菌20 min，使用氮?dú)獯得?0 min以去除培養(yǎng)基中的溶解氧，創(chuàng)造缺氧環(huán)境。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：由于Na2S·9H2O極易被氧化，不易測得其準(zhǔn)確濃度，故選擇Na2S2O3·5H2O代替培養(yǎng)基中的Na2S·9H2O來配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基[18]，用于測定菌株氧化去除硫化物的效果，其它成分及操作不變。

1.2 固定化載體

本文使用的固定化載體為沸石和陶粒，將載體研磨過篩，得到18目(直徑為1 ～ 2 mm)、30目(直徑為0.6 ～1.0 mm)及60目(直徑為0.25 ～0.6 mm)三種粒徑的載體。

1.3 載體的預(yù)處理

使用0.1 mol·L-1的磷酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)蒸餾水的pH依次為1、3、5、6、8、9、11，取1g載體材料投進(jìn)5 mL不同pH的溶液中，150 r·min-1振蕩吸附30 min，靜置24 h，使用蒸餾水沖洗改性載體至沖洗液pH呈中性，105 ℃干燥2 h即得到改性載體；同樣取沸石和陶粒，蒸餾水清洗，105 ℃干燥2 h，即未改性載體；所有載體高壓蒸汽滅菌后備用。

1.4 固定化過程

將菌種按10%的接種量接入50 mL選擇性培養(yǎng)基，30 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，然后在菌液(>109CFU·mL-1)中加入1 g載體材料，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h，進(jìn)行微生物細(xì)胞的吸附固定。使用無菌生理鹽水沖洗載體3次，除去表面未固定的游離細(xì)菌，獲得固定化菌劑。

1.5 分析檢測項(xiàng)目及方法

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株對硫化物的氧化能力

從圖1可以看出，該菌株在24 h時(shí)對4.65 g·L-1的Na2S2O3·5H2O的去除率可達(dá)到100%；而未加菌的對照組對硫化物也有約5%去除率，這可能是由于培養(yǎng)基中存在的微量氧氣造成的。通過與對照比較，可以確定約95%的硫化物去除是由微生物參與完成的。

圖1 非固定化硫氧化菌株TT對硫化物的氧化去除能力Fig.1 The sulfide removal rate of suspended strain TT

馮守帥等[22]研究的硫氧化菌ThermithiobacillustepidariusJNU-2以2 g·L-1的Na2S2O3為能源底物，24 h時(shí)可去除98%的Na2S2O3，同時(shí)單質(zhì)硫的最大產(chǎn)量可達(dá)到0.8 g·L-1。而Chen等[23]將硫氧化菌Penibacillussp.和Aneurinibacillusaneurinilyticus應(yīng)用于膨脹顆粒污泥床反應(yīng)器，其對硫化物的氧化速率達(dá)到了3.0 g·(L·d)-1。與上述菌株相比，本文分離得到的硫氧化菌株TT擁有更高效的氧化還原性硫化物的能力。同時(shí)，硫化物菌株TT可在20～40 ℃之間均可獲得較好的硫氧化能力，其最優(yōu)生長條件為：30～40 ℃，pH為7.0～9.0。該菌為兼性化能自養(yǎng)菌，可同時(shí)利用無機(jī)碳和有機(jī)碳作為碳源[24]。由于膠州灣養(yǎng)殖區(qū)夏季的平均溫度為27.8 ℃[25]，且該菌在堿性環(huán)境中可發(fā)揮較好的硫氧化能力，可見菌株TT可作為合適的工程菌株應(yīng)用于海水養(yǎng)殖生境的生物修復(fù)。

2.2 載體的選擇及效果

以18、30及60目的沸石和陶粒為載體，采用吸附的方法對硫氧化菌株TT進(jìn)行了固定化。固定后的載體在pH=7.0、30 ℃條件下對硫代硫酸鹽的去除效果如圖2，18目固定化菌劑24 h時(shí)對硫代硫酸鹽的去除率可達(dá)到42.7%,去除效果最好。

圖2 不同載體和粒徑對固定化效果的影響Fig.2 The effect of different carriers and particle size on immobilization

已知游離的菌液24 h時(shí)對硫代硫酸鹽的去除率為100%(見圖2)，可見固定化菌劑的去除率有所降低，這可能是由于大量的微生物細(xì)胞并未吸附到固定化載體上[26]，或是由于硫化物在載體材料中的擴(kuò)散遷移受到了限制[27]，從而導(dǎo)致固定后的菌劑硫氧化能力下降。與陶粒相比,不同粒徑沸石固定化菌劑對還原性硫化物的氧化能力遠(yuǎn)低于陶粒，這可能與載體的表面形態(tài)有關(guān)。沸石和陶粒的SEM圖如圖3，沸石表面無孔隙，但表面較粗糙；而陶粒表面有許多孔隙，比表面積較大，能夠吸附大量的微生物細(xì)胞并為其提供生長空間[28]。

陶粒及沸石兩種載體均在18目粒徑下表現(xiàn)出了更好的硫氧化性能。研究表明，固-液界面相互作用過程中，滲透性較差的多孔介質(zhì)表面形成的水化膜限制了污染物的擴(kuò)散遷移，使得功能微生物無法與污染物充分接觸，從而影響固定化載體對目標(biāo)污染物的去除效果。顆粒粒徑會對多孔介質(zhì)的滲透性產(chǎn)生重要影響[29]。粒徑越大，多孔介質(zhì)的滲透性越好，良好的滲透性能夠保證液體中污染物與固定化菌劑中微生物進(jìn)行充分接觸，從而達(dá)到較好的去除效果。這也可能是18目粒徑下的固定化菌劑對硫化物去除效果好的原因。同時(shí)由于粒徑較小的載體較難與游離態(tài)菌液分離，難以應(yīng)用于實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境，故選擇18目的陶粒進(jìn)行以下研究。

圖3 未吸附載體沸石(a)及陶粒(b)Fig.3 SEM observation of zeolite(a) and ceramsite(b)

2.3 載體的預(yù)處理

對載體材料表面基團(tuán)或孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得合適的固定化材料已成為細(xì)胞固定化研究的重要方向[30]。陶粒內(nèi)部呈細(xì)密蜂窩狀微孔結(jié)構(gòu)，利用酸堿對陶粒進(jìn)行改性，置換陶?？椎乐性械陌霃酱蟮年栯x子，使孔洞的有效孔徑拓寬，增加表面積[31]，從而影響陶粒的離子交換和吸附吸能，增加吸附活性中心[32]。用酸堿改性處理后的陶粒分別吸附固定化硫氧化菌株TT，研究其對硫代硫酸鹽的去除能力，結(jié)果如圖4。

圖4 酸、堿改性對固定化效果的影響Fig.4 The effects of modified carriers onimmobilization

與未改性陶粒相比，采用酸堿改性方法處理過后的固定化菌劑對硫代硫酸鹽的去除能力均有顯著提高，而用1.0 mol·L-1NaOH處理的陶粒吸附菌可獲得更好的固定化效果。其中利用pH=8的NaOH溶液對陶粒載體進(jìn)行改性后進(jìn)行固定化，其固定化菌株的硫氧化能力提高了35%左右。

2.4 固定化顆粒表面結(jié)構(gòu)分析

載體的吸附特性不僅取決于它的孔隙結(jié)構(gòu)，同時(shí)其表面化學(xué)性質(zhì)也具有很大影響。而表面化學(xué)性質(zhì)主要由表面的官能團(tuán)決定，不同的官能團(tuán)對不同的吸附質(zhì)有明顯的吸附差別。采用傅里葉紅外光譜對未改性陶粒、酸改性陶粒及堿改性陶粒的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5。陶粒在3 400 cm-1處有一個(gè)O-H伸縮振動吸收峰，1 081 cm-1為Si-O伸縮振動峰，796、691及462 cm-1處為Si-O、Al-O彎曲振動峰；酸堿改性并未改變陶粒紅外骨架，主要影響了陶粒本身的O-H含量，酸改性陶粒較未改性陶粒的O-H峰強(qiáng)度減弱，而堿改性的陶粒O-H峰強(qiáng)度增強(qiáng)。O-H這種極性較強(qiáng)的基團(tuán)的增加可以提高載體對弱極性物質(zhì)吸附的表面活性[33]。這可能是堿改性載體固定化效果提高的原因。

圖5 陶粒在不同改性條件下的FTIR譜圖Fig.5 FTIR spectrum of ceramsite obtained from different modified conditions

不同處理?xiàng)l件下的陶粒掃描電鏡圖譜如圖6。與未處理陶粒相比(見圖3)，酸堿改性的陶?？紫对龆?，比表面積增大，這可能是酸堿改性后載體吸附能力提高的原因之一。同時(shí)堿改性陶粒5 μm左右的大孔隙較多，由于本研究中使用的微生物細(xì)胞長度>1 μm，因此大孔隙的增加有利于微生物細(xì)胞的吸附。

2.5 固定化菌劑的重復(fù)利用性

固定化的一大優(yōu)勢就是固定化載體的重復(fù)利用，不同的固定方式?jīng)Q定了不同的復(fù)用性[34]。而相比較于其他的固定方法，吸附法的復(fù)用性最好[35]。固定化菌劑的復(fù)用性結(jié)果如圖7。

圖6 陶粒酸改性(a)及堿改性(b)后的掃描電鏡照片及吸附的菌體(c)Fig.6 SEM of acid(a) and alkali-modified ceramsite(b) and strain TT on carrier(c)

圖7 固定化菌劑的復(fù)用性Fig.7 The reusability of the immobilized sulfur-oxidizing bacteria cell

固定化菌劑在第一次使用過后，其對還原性硫化物的氧化能力得到了一定的提升，這表明微生物細(xì)胞可在陶粒載體上進(jìn)一步增殖。吸附于載體上的微生物細(xì)胞與載體間除物理吸附外可能發(fā)生了生物吸附，從而形成菌膜，增加菌體密度[36]。同時(shí)，重復(fù)使用過程中，載體上脫落下來的微生物會在底物充足的情況下進(jìn)一步增殖，在水中及吸附在載體上的微生物進(jìn)一步增多，導(dǎo)致重復(fù)使用后固定化菌劑對硫化物的去除率提高。6次重復(fù)使用后，固定化菌劑的硫氧化能力并沒有明顯變化，仍表現(xiàn)出顯著的分解代謝能力，說明該固定化菌劑具有較好的復(fù)用性并且能夠長期應(yīng)用于海水養(yǎng)殖環(huán)境。

3 結(jié)語

以陶粒和沸石為載體，采用吸附的方法對具有高效硫氧化能力的菌株TT進(jìn)行了固定化。為了進(jìn)一步提高固定化效果，采用不同的改性方法提高載體的吸附性能，并考察了固定化菌劑的硫氧化能力。陶粒由于孔隙較多，固定化效果比沸石更好些；通過酸堿改性可提高固定化載體的吸附效果，其中堿改性陶粒(pH=8)的效果最好，硫氧化能力提高了35%，達(dá)到75%左右；堿改性陶粒對硫氧化菌株具有較好的吸附固定化能力，且復(fù)用性較好，在海水養(yǎng)殖生境修復(fù)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。