李慧，陳曦，昌曉紅

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在 40 歲之前出現(xiàn)的以卵巢功能過早衰竭（如月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕等）為主要臨床表現(xiàn)的綜合征[1]。雌激素水平低和不孕是對育齡婦女的兩大威脅。近年來，癌癥在育齡期女性中的發(fā)病率逐漸增加，雖然化療可延長癌癥患者生存時間，但也會出現(xiàn)一些副作用，其中化療引起的 POF 越來越受到關注。有研究報道化療藥物主要通過損害卵巢顆粒細胞 DNA 及激活細胞凋亡通路等誘導顆粒細胞凋亡，繼而引起卵泡閉鎖，降低卵巢功能[2]。

顆粒細胞是一種卵巢合成和分泌抑制素、雌激素的主要功能細胞，在女性卵泡的生長、發(fā)育和成熟，黃體生成等方面發(fā)揮著重要作用。顆粒細胞在卵母細胞的成熟和發(fā)育中起到支持雌激素介導的調(diào)節(jié)作用，并維持卵巢的激素平衡，以通過自分泌和旁分泌機制促進卵母細胞成熟。顆粒細胞生長的好壞對卵泡的發(fā)育、成熟及激素的分泌具有至關重要的作用。顆粒細胞功能失調(diào)時，常常引起卵泡發(fā)育障礙和激素分泌異常，最終導致卵泡閉鎖。

目前，POF 的治療方法主要為激素替代療法，該療法主要以改善癥狀為主，長期使用可引發(fā)心血管疾病、腫瘤等患病風險。大量研究表明間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可以抑制顆粒細胞凋亡，改善卵巢早衰動物卵巢儲備功能，增加卵泡數(shù)和排卵[3-5]，這些證據(jù)表明間充質(zhì)干細胞治療 POF 具有潛在的臨床應用價值。MSCs 可從多種組織中分離出來，包括骨髓、神經(jīng)組織、脂肪組織、羊水、胎盤和臍帶等，具有自我更新及多系分化潛能，可分化成不同的祖細胞[6]?，F(xiàn)就間充質(zhì)干細胞對卵巢顆粒細胞影響方式進行綜述。

1 MSCs 對 POF 中顆粒細胞干細胞特性的影響

顆粒細胞并不是終末分化的細胞，它們可以進一步發(fā)生黃素化，或者轉變?yōu)?Sertoli 細胞，在分裂方式及增殖方面雖然不具有干細胞的生物學特點，但其可表達多種具有多潛能分化功能的基因，該現(xiàn)象得到了大量研究支持。2009年，Kossowska-Tomaszczuk 等[7]研究發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中長期存在白血病抑制因子（leukemia-inhibiting factor，LIF）時，顆粒細胞表面標志物 FSHR 表達逐漸消失，分泌激素的功能逐漸降低，同時出現(xiàn)干細胞標志 POU5F1、CD29、CD44、CD90、CD105 表達，體外培養(yǎng)時可分化成骨、軟骨及神經(jīng)元細胞等，該研究表明人卵巢中黃素化顆粒細胞具有干細 胞的特性，為后續(xù)顆粒細胞干細胞研究打下了基礎。Dzafic 等[8]發(fā)現(xiàn)從廢棄的卵泡液里分離出的顆粒細胞表達干細胞標志物，如 OCT-4、NANOG 和 SOX-2，顯示出高端粒酶活性，同時在體外可分化成其他細胞類型。也有研究報道，顆粒細胞表達多能干細胞標志物，包括 Nanog、Sox-2 和 TERT 等[9]，與上述結果一致。Yousefi 等[10]比較了兩種不同的體外培養(yǎng)條件，即卵泡液與胎牛血清對顆粒細胞多能性的影響，結果顯示在體外培養(yǎng)不超過 14 d 時，卵泡液更有利于顆粒細胞多能性的維持，可為后續(xù)用于誘導人顆粒細胞中干細胞特異性因子表達的培養(yǎng)基添加物提供依據(jù)。Maleki 等[11]比較了人體各種組織來源 MSCs 樣細胞表面特異性干細胞標志物的表達，其中顆粒細胞與臍帶來源 MSCs 均表達 CD44、CD90、CD105、CD106、CD146、CD166 和 Stro-1 等常見的間充質(zhì)干細胞的特征抗原，其中 CD44 的高表達有助于細胞的干性功能維持。Dzafic 等[12]應用 RT2 Profiler PCR array 技術，分析了 87 種與干細胞 MCSs 相關的基因表達譜，同時與骨髓間充質(zhì)干細胞進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞能夠表達 57 種與骨髓間充質(zhì)干細胞相同的基因，其中 16 種基因表達上調(diào)，20 種基因表達下調(diào)。而其中優(yōu)勢生長的顆粒細胞則能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞和胰腺細胞。盡管目前的研究表明顆粒細胞具有干細胞的特性，然而大多數(shù)研究僅局限在顆粒細胞與間充質(zhì)干細胞表面標志物表達情況的比較，干細胞能否影響顆粒細胞干性特征仍未明確，需進一步研究。

2 間充質(zhì)干細胞對 POF 中顆粒細胞凋亡的調(diào)控

目前 POF 的病因仍未明確，可能與遺傳、內(nèi)分泌、代謝、線粒體障礙、DNA 損傷等影響卵泡的發(fā)育相關。有研究報道 POF 發(fā)生最重要的機制是卵泡功能障礙和卵泡耗竭[13]。卵巢顆粒細胞的凋亡是影響卵巢儲備和功能下降的重要機制。因此，抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，避免卵泡閉鎖，就有可能延緩或避免卵巢早衰的發(fā)生。一些研究表明，MSCs 可抑制 POF 動物模型中和體外顆粒細胞的凋亡。Yin 等[14]將人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞（hPMSCs）用于 POF 小鼠后，小鼠卵巢功能得到明顯改善，性周期、卵泡發(fā)育及激素 分泌均恢復正常，顆粒細胞凋亡數(shù)量明顯減少，進一步研究發(fā)現(xiàn) hPMSCs 可能通過 Treg 細胞和細胞因子等改善小鼠卵巢功能。Xia 等[15]將竇前卵泡與間充質(zhì)干細胞進行體外共培養(yǎng)，一段時間后發(fā)現(xiàn)，MSCs 以劑量依賴方式改變卵泡存活率，增加卵泡生長速度，改善竇前卵泡的生存能力。進一步分析顯示，MSCs 可促進卵母細胞 GDF9 和 BMP15 的表達，促進顆粒細胞抑制素 β 和 TGFβ 的表達。該研究提示：MSCs 可促進竇前卵泡的發(fā)育，通過促進體外卵泡生長，為生育力保護和保存提供很好的策略。Ding 等[16]將人羊膜間充質(zhì)干細胞（hAMSCs）與自然衰老的人顆粒細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)一周后發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞增殖率明顯增加，細胞表面 AMH、FSHR、FOXL2、CYP19A1 的表達明顯增加，提示 hAMSCs 可能通過改善顆粒細胞的功能阻止人自然年齡卵巢功能的減退。Manshadi 等[17]建立 POF 小鼠模型，分為人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞（HuMenSCs）治療組和對照組，HuMenSCs 治療組顆粒細胞表面 AMH、FSHR 的表達明顯增加，雌激素分泌增加，卵巢功能明顯改善。通過標記 HuMenSCs，發(fā)現(xiàn)細胞主要定位在卵泡周圍顆粒細胞層，該研究認為 HuMenSCs 能夠分化顆粒細胞，同時具有分泌激素的能力。骨髓間充質(zhì)干細胞 BMSCs 同樣具有改善顆粒細胞生長，恢復 POF 模型卵巢功能的能力[18-19]。Fu 等[20]在體外培養(yǎng) BMSC 時，發(fā)現(xiàn)細胞分泌 VEGF、HGF、IGF-1 等生長因子，同時發(fā)現(xiàn)該細胞可抑制顆粒細胞凋亡和 Bcl2 蛋白的表達。BMSCs 可以改善圍絕經(jīng)期和順鉑誘導的顆粒細胞的凋亡[21]。有研究者將自體 BMSCs 治療特發(fā)性 POF 患者，結果顯示，2 例（20%）在移植后 3 個月恢復月經(jīng)，其中一例（10%）懷孕并分娩了一個健康的嬰兒，提示間充質(zhì)干細胞可用于 POF 的治療，具體的作用機制仍需進一步探索[22]。采用熱休克 HS 技術預處理大鼠骨髓 MSCs，提高干細胞抗凋亡能力，保證用于移植干細胞的數(shù)量和活力。將 HS 預處理的細胞與化療藥物預處理的顆粒細胞 1:1 共培養(yǎng)，檢測顆粒細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn) HS 預處理可抑制化療誘導的顆粒細胞凋亡。同時將 HS 預處理 MSCs 注射到 POF 大鼠雙側卵巢，發(fā)現(xiàn)可進一步改善化療期間的卵巢結構和內(nèi)分泌功能，且該組顆粒細胞凋亡數(shù)明顯少于 POF 模型組及 MSCs 治療組。顆粒細胞的凋亡與卵泡閉鎖密切相關。隨著顆粒細胞的凋亡減少，卵泡閉鎖也減少。該研究認為，HS 預處理增強 MSCs 修復作用的能力與抑制顆粒細胞的凋亡有關[23-25]。Xiao 等[26]研究發(fā)現(xiàn)羊水干細胞（amniotic fluid stem cells，AFSCs）來源外泌體可在體外預防環(huán)磷酰胺誘導的顆粒細胞的凋亡。同時 AFSCs 來源外泌體可通過 miR-146a 和 miR-10a 抑制顆粒細胞凋亡，從而預防環(huán)磷酰胺誘導的小鼠模型的卵泡閉鎖。Sun 等[27]通過提取人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，huMSCs）來源的外泌體處理順鉑誘導的顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)細胞活力增加，細胞凋亡相關基因 Bcl2、caspase3 表達上調(diào)，Bax、cleaved caspase3、cleaved PARP 的表達下調(diào)。該研究認為 huMSCs 來源的外泌體可在體外預防順鉑 誘導的顆粒細胞的損傷，為后續(xù)干細胞治療 POF 提供了新的證據(jù)。

3 干細胞可發(fā)生顆粒細胞樣改變

卵巢皮質(zhì)中的卵泡數(shù)量和質(zhì)量、卵泡生長能力、卵巢發(fā)育和卵母細胞的形成決定卵巢儲備和功能。而卵巢儲備和功能是衡量女性生殖內(nèi)分泌功能和生育潛力的指標。卵母細胞的質(zhì)量直接影響卵巢的儲備和功能，而顆粒細胞質(zhì)量差，最終可能導致 POF 的發(fā)生。有研究報道，人誘導多能干細胞可在體外多種因子的作用下分化成卵巢顆粒樣細胞，細胞可表達 AMH、inhibin α、inhibin β 及 FSH 受體分子，但不表達 OCT-4、Nanog 等干細胞標志物。當這些顆粒樣細胞注入 POF 小鼠體內(nèi)時，可改善小鼠卵巢顆粒樣細胞的生長，修復卵巢損傷，維持卵巢結構的完整性，以及促進卵泡的生長和發(fā)育[28]。Lan 等[29]在體外培養(yǎng)條件下將胚胎干細胞誘導分化為有功能的顆粒樣細胞，該細胞可分泌 AMH 和雌激素等，該研究為卵泡形成和激素分泌提供了可能，為后續(xù)深入研究提供了方向。以上研究表明，干細胞可在體外誘導分化為顆粒樣細胞，具有顆粒細胞內(nèi)分泌功能，可改善卵泡的生長和發(fā)育，為 POF 的治療提供了新方向。

綜上所述，MSCs 在體內(nèi)外與顆粒細胞共培養(yǎng)時，可能通過影響顆粒細胞干細胞潛能、調(diào)控顆粒細胞凋亡或誘導分化為顆粒細胞來發(fā)揮各種生物學功能，從而促進卵泡的生長和發(fā)育，改善卵巢儲備和功能，逆轉 POF。MSCs 具有高增殖潛力，自我更新潛力和多重分化潛能，大量研究表明 MSCs 可改善 POF 動物模型的卵巢結構和功能，這些都預示著 MSC 在 POF 治療方面具有光明的臨床轉化應用前景。然而，MSCs 對卵巢早衰中顆粒細胞具體作用機制仍未明確，仍需進一步研究。