張南 王蓮 劉蓮 張自暉 蔣獻

四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚科，成都 610041

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）發(fā)病機制復(fù)雜，可能與遺傳、環(huán)境、免疫和皮膚屏障功能改變有關(guān)，而免疫異常是其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往認(rèn)為，AD為經(jīng)典Th1/Th2失衡疾病，但隨著新CD4+T細(xì)胞亞群Th17、Th22細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，證實這4種T細(xì)胞亞型均可通過分泌各種細(xì)胞因子在AD的不同階段參與致?。?］。這些細(xì)胞因子在AD不同病程時期分泌量不同，在不同人種、年齡和疾病嚴(yán)重程度AD患者中的組成也不同，如亞洲AD患者Th17細(xì)胞明顯極化［2］；AD兒童中存在Th1和Th2細(xì)胞失衡，而成年AD患者皮膚中Th22細(xì)胞數(shù)更高［3］；重度AD患者外周血Th2和Th22細(xì)胞增加，但Th17細(xì)胞增加不明顯［4］。這些失調(diào)的細(xì)胞因子能從多角度影響皮膚屏障功能，包括下調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞分化基因的表達(dá)，改變皮膚屏障結(jié)構(gòu)。本文就AD中細(xì)胞因子對皮膚屏障的影響做一綜述。

一、表皮屏障

表皮中的許多結(jié)構(gòu)及成分對皮膚屏障功能有重要作用，包括角蛋白、絲聚蛋白、角化包膜、細(xì)胞間連接、蛋白酶及蛋白酶抑制劑、脂質(zhì)等，當(dāng)它們的功能和結(jié)構(gòu)被破壞時，皮膚屏障功能將被削弱。

角蛋白是角質(zhì)形成細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)蛋白，屬于分化標(biāo)志物。表皮細(xì)胞分化過程中還伴隨絲聚蛋白、內(nèi)披蛋白、兜甲蛋白、小分子富含脯氨酸蛋白等的表達(dá)。絲聚蛋白與角蛋白形成致密的纖維束，構(gòu)成堅韌的骨架結(jié)構(gòu)，兜甲蛋白、內(nèi)披蛋白、小分子富含脯氨酸蛋白在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的催化作用下交叉形成不溶于水的角化包膜。絲聚蛋白原在酶解作用下裂解為絲聚蛋白單體，在角質(zhì)層上部，被降解產(chǎn)生天然保濕因子，是維持角質(zhì)層水合和表皮酸堿度的關(guān)鍵，這個過程由胱天蛋白酶14、鈣蛋白酶1和博來霉素調(diào)節(jié)［5］。

細(xì)胞間連接包括角質(zhì)層的角化橋粒和緊密連接，角化橋粒包括角化橋粒蛋白、橋粒芯糖蛋白、橋粒糖蛋白，緊密連接主要包括密封蛋白、閉合蛋白、帶狀閉合蛋白1～3。角質(zhì)細(xì)胞的脫落主要是由激肽釋放酶5和7水解角化橋粒調(diào)節(jié)，這些蛋白酶的活性隨pH增加而增強。其活性也受多種蛋白酶抑制劑嚴(yán)格調(diào)控，包括絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal-5型基因編碼的淋巴Kazal-5型絲氨酸蛋白酶抑制劑［6］。

角質(zhì)層主要的脂質(zhì)成分包括神經(jīng)酰胺、脂肪酸和膽固醇，它們形成滲透屏障，能防止蒸發(fā)失水。神經(jīng)酰胺作用最為關(guān)鍵，其中ω羥基神經(jīng)酰胺不可或缺，其存在于每個角質(zhì)細(xì)胞表面，通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶1與內(nèi)披蛋白支架結(jié)合［5］。神經(jīng)酰胺合成途徑包括從頭合成途徑及酶解途徑。從頭合成途徑關(guān)鍵酶為絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶；酶解途徑主要酶包括鞘磷脂酶和葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶。

二、表皮分化復(fù)合物

表皮分化復(fù)合物基因呈簇狀分布于染色體1q21上，編碼主要分化蛋白和參與角化包膜的形成。其中包括絲聚蛋白、內(nèi)披蛋白、兜甲蛋白、小分子富含脯氨酸蛋白和鈣結(jié)合蛋白1～13（S100A1-A13）。表皮分化復(fù)合物與表皮的終末分化密切相關(guān)。［7］

三、Th2型細(xì)胞因子對皮膚屏障的影響

Th2細(xì)胞是AD發(fā)病中的主要免疫細(xì)胞，在AD的疾病進程中主要分泌白細(xì)胞介素4（IL-4）、IL-5、IL-13、IL-31，其中IL-4、IL-13和IL-31對皮膚屏障功能影響研究較為廣泛。

1.IL-4：Danso等［8］發(fā)現(xiàn)，IL-4能降低絲聚蛋白、兜甲蛋白和角蛋白10基因及蛋白水平。正常人角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT中，IL-4、IL-13顯著減少絲聚蛋白、淋巴Kazal-5型絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱天冬酶14 mRNA表達(dá)，同時增加激肽釋放酶5和7、通道活化的絲氨酸蛋白酶1 mRNA表達(dá)［9］。重組人表皮角化模型中［10］，IL-4下調(diào)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2和葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶基因的轉(zhuǎn)錄，且下調(diào)葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶的酶活性，鞘磷脂酶基因表達(dá)減少，但其酶活性卻輕微增加。這些改變導(dǎo)致神經(jīng)酰胺合成減少，其中ω羥基神經(jīng)酰胺下降最為顯著，從而進一步破壞角質(zhì)層的完整性。

Morizane等［11］用IL-4刺激正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞后，激肽釋放酶7的mRNA表達(dá)和酶活性均增加，從而促進角化橋粒蛋白的降解，破壞角質(zhì)層連接，增加經(jīng)皮水分丟失。但Hatano等研究表明［12］，IL-4注射后的小鼠角質(zhì)層中角化橋粒含量減少，IL-4能減少橋粒芯糖蛋白1基因和蛋白的表達(dá)，激肽釋放酶7基因表達(dá)增加，但總絲氨酸蛋白酶活性未改變，提示IL-4可不依賴激肽釋放酶直接調(diào)節(jié)細(xì)胞間凝聚力。另有研究顯示，IL-4處理的人原代角質(zhì)形成細(xì)胞中角化橋粒蛋白基因表達(dá)減少［13］。IL-4除了影響角化蛋白表達(dá)，還能減少緊密連接分子的表達(dá)。IL-4和IL-13分別處理人角質(zhì)形成細(xì)胞后，均出現(xiàn)細(xì)胞表面E鈣黏蛋白和β聯(lián)蛋白表達(dá)減少［14］。此外，IL-4還能顯著抑制密封蛋白1在人皮膚中的表達(dá)［15］。

2.IL-13：AD患者的血清和皮損中IL-13表達(dá)水平升高。IL-13受體包括1個與IL-4相同的受體IL-4Rα及另外2個同源受體IL-13Rα1和IL-13Rα2，故IL-13和IL-4可通過共同受體發(fā)揮類似的作用，兩者均可降低表皮分化復(fù)合物基因的表達(dá)，促進角質(zhì)細(xì)胞的脫落，增加經(jīng)皮水分丟失。［16］

IL-4、IL-13對角質(zhì)形成細(xì)胞的影響是多途徑的。Amano等［17］通過基因本體論發(fā)現(xiàn)，IL-4和IL-13均下調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)基因組，siRNA沉默信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）后，絲聚蛋白和兜甲蛋白mRNA的表達(dá)上調(diào)，而沉默STAT6對絲聚蛋白和兜甲蛋白無明顯影響，推測IL-4和IL-13可通過STAT3通路調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞分化。近期的分子機制研究發(fā)現(xiàn)［18］，STAT6競爭性地抑制p300/CBP與兜甲蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的結(jié)合，從而抑制兜甲蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。此外，IL-4和IL-13還能刺激角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素，通過激活角質(zhì)形成細(xì)胞STAT3和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，抑制絲聚蛋白的表達(dá)［19］。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在急性和慢性AD皮損中表達(dá)增加，能激活樹突細(xì)胞以促進IL-4、IL-13分泌，加劇Th2炎癥反應(yīng)的應(yīng)答。

Dupilumab是抗IL-4Rα受體拮抗劑，能阻斷IL-4及IL-13活性，是目前第一個用于治療成人中重度AD的生物制劑，在2 447例成人AD患者的Ⅲ期試驗中取得較好的臨床療效，濕疹面積嚴(yán)重指數(shù)、AD評分、皮膚生活質(zhì)量評分和瘙癢等級評分均有改善［20］。

3.IL-31：AD皮損中IL-31 mRNA和蛋白水平均升高，外周血IL-31水平與AD患者的病情嚴(yán)重度成正比，且主要介導(dǎo)瘙癢產(chǎn)生［21］。IL-31也影響角質(zhì)形成細(xì)胞分化、細(xì)胞連接和脂質(zhì)水平。皮膚3D模型中［22］，IL-31下調(diào)絲聚蛋白、半胱天冬酶14、激肽釋放酶7、橋粒糖蛋白1和2、橋粒芯糖蛋白1和4基因表達(dá)。Singh等［23］在重組人IL-31（rIL-31）注射后的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，IL-31可促進基底細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)表皮增厚，小鼠表皮明顯增厚，且Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)增加；IL-31還能增加其他促進增殖和皮膚重塑的細(xì)胞因子表達(dá)，包括IL-6、IL-1β等；同時，rIL-31注射后小鼠經(jīng)皮水分丟失值在第7和14天均較注射生理氯化鈉溶液對照組明顯升高，提示屏障功能破壞。IL-31還影響緊密連接E鈣黏蛋白、β聯(lián)蛋白、密封蛋白1的表達(dá)［13-14］，并能減少ω-羥基神經(jīng)酰胺水平，影響脂質(zhì)組成［8］。

四、Th22細(xì)胞因子對皮膚屏障的影響

Th2型細(xì)胞因子的作用并不能解釋慢性AD患者的表皮增厚，Th22細(xì)胞的浸潤和大量IL-22的產(chǎn)生進一步推動了疾病向慢性期轉(zhuǎn)化，在這一階段，IL-22與γ干擾素（IFN-γ）共同誘導(dǎo)表皮增生。

Th22細(xì)胞主要分泌IL-22，其在急性期表達(dá)增加，且含量與AD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［24］。IL-22轉(zhuǎn)基因小鼠表皮較野生型小鼠增厚，且IL-22處理后的人類表皮模型，橋粒芯糖蛋白1、鈣調(diào)蛋白樣蛋白5、角蛋白10基因表達(dá)減少［25］。角蛋白10是終末分化的角質(zhì)形成細(xì)胞的特征，其缺乏會造成表皮完整性受損。鈣調(diào)蛋白樣蛋白5是一種鈣結(jié)合蛋白，與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3相互作用，影響角化包膜的形成。此外，加入IL-22的人原代角質(zhì)形成細(xì)胞中［26］，除絲聚蛋白原、角蛋白1和10基因表達(dá)減少外，另一分化標(biāo)志物激肽釋放酶7基因的表達(dá)也減少，提示IL-22抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分化，且抑制細(xì)胞間連接，使橋粒糖蛋白1基因表達(dá)減少，導(dǎo)致滲透性增加。Boniface等［27］發(fā)現(xiàn)，IL-22誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增生，導(dǎo)致重組人表皮增厚，而這種效應(yīng)并不是由于基底細(xì)胞增殖增加，而是因表皮分化被抑制引起。將IL-22Tg（+）轉(zhuǎn)基因小鼠浸入甲苯胺藍(lán)溶液，小鼠皮膚完全著色，提示皮膚通透性明顯增加，且暴露于屋塵螨過敏原后易出現(xiàn)皮炎表現(xiàn)，進一步PCR檢測發(fā)現(xiàn)，IL-22能減少原代角質(zhì)形成細(xì)胞中絲聚蛋白2、密封蛋白1和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3基因表達(dá)［28］。

五、Th1細(xì)胞因子對皮膚屏障的影響

在AD慢性期，極化Th1細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。正常人角質(zhì)形成細(xì)胞和永生化上皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）中，與IL-4、IL-13作用相反，IFN-γ能顯著增加絲聚蛋白和淋巴Kazal-5型絲氨酸蛋白酶抑制劑mRNA的表達(dá)，顯著減少激肽釋放酶5和7、通道活化的絲氨酸蛋白酶1 mRNA表達(dá)，同時增加胱天蛋白酶14 mRNA表達(dá)［9］。IFN-γ可上調(diào)E鈣黏蛋白和β聯(lián)蛋白表達(dá)，增加角質(zhì)形成細(xì)胞間的連接［13］。此外，IFN-γ通過上調(diào)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1和2、鞘磷脂酶及葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶轉(zhuǎn)錄，并增加葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶活性，從而增加角質(zhì)層神經(jīng)酰胺水平，這些結(jié)果與IFN-γ減少經(jīng)皮水分丟失一致［10］。培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中，IFN-γ下調(diào)長鏈脂肪酸延長酶以及神經(jīng)酰胺合成酶mRNA的表達(dá)，從而使神經(jīng)酰胺中游離脂肪酸鏈長度減少，這些改變引起脂質(zhì)組成異常并導(dǎo)致皮膚屏障破壞［29］。

六、Th17細(xì)胞因子對皮膚屏障的影響

Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，主要產(chǎn)生IL-17和IL-22，是角質(zhì)形成細(xì)胞中抗菌肽的重要調(diào)節(jié)因子。急性AD患者外周血和皮損中Th17細(xì)胞數(shù)量增加，但慢性AD患者Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17減少，這種現(xiàn)象被認(rèn)為是Th2細(xì)胞因子抑制了Th17細(xì)胞的產(chǎn)生和活化［30］，從而減少抗菌肽的產(chǎn)生，這可能解釋了為什么AD患者較銀屑病患者易發(fā)生感染。

培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-17可減少絲聚蛋白原和其加工酶的基因表達(dá)，且蛋白印跡法表明，IL-17能降低絲聚蛋白單體含量［31］。3D皮膚模型中，IL-17處理后表皮變薄，絲聚蛋白及其DNA水平較空白對照組降低，且S100A7表達(dá)明顯上調(diào)，S100A7是一個控制細(xì)胞增殖和分化的蛋白，且具有抗菌肽活性。同時還觀察到IL-17能抑制分化相關(guān)標(biāo)志物絲聚蛋白2、兜甲蛋白、角蛋白10的表達(dá)［32］。體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-17可下調(diào)密封蛋白7、E鈣黏蛋白、帶狀閉合蛋白2以及各種整合素基因表達(dá)，同時組織染色觀察到E鈣黏蛋白、帶狀閉合蛋白1蛋白水平下降，削弱了角質(zhì)形成細(xì)胞間的連接［33］。人皮膚類似物模型中，IL-17下調(diào)帶狀閉合蛋白1、密封蛋白1和4蛋白的表達(dá)［34］。

七、上皮細(xì)胞來源細(xì)胞因子對皮膚屏障的影響

胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素、IL-33和IL-25可由上皮細(xì)胞分泌，這3種細(xì)胞因子均可誘發(fā)Th2型炎癥反應(yīng)，且可相互作用促進炎癥發(fā)展。除間接損傷皮膚屏障外，近期研究表明，IL-25和IL-33可直接影響屏障功能。IL-25是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，屬于IL-17家族，也被稱為IL-17E。在AD患者皮損中［35］，IL-25及其受體IL-17Rh1含量均升高，用IL-25處理正常人原代角質(zhì)形成細(xì)胞后，絲聚蛋白mRNA水平下降。IL-33是IL-1家族成員，由于其在組織損傷、生理應(yīng)激狀態(tài)或皮膚搔抓后釋放，故被稱為“預(yù)警素”，在AD患者的皮膚和小鼠AD樣皮損中表達(dá)上調(diào)。在單層培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞中［36］，IL-4上調(diào)IL-33 mRNA表達(dá)，IL-33明顯下調(diào)絲聚蛋白和內(nèi)披蛋白mRNA表達(dá)，且經(jīng)IL-33處理的人表皮類似物中有核細(xì)胞層厚度明顯減少，但在3D皮膚模型中未觀察到IL-33對分化相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響。另一研究顯示［37］，IL-33能減少皮膚絲聚蛋白水平。因此，IL-33可能直接或間接引起表皮屏障損傷，從而在AD局部炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

八、結(jié)語

除Dupilumab外，抗IL-13單克隆抗體Lebrikizumab和Tralokinuma、抗IL-31單克隆抗體Nemolizumab、抗IL-22抗體Fezakinumab在二期臨床試驗中證實均可改善AD患者嚴(yán)重程度評分及皮膚受累面積［38］。近年來，生物靶向治療的進展使得細(xì)胞因子在AD發(fā)病中的作用受到關(guān)注。本文僅綜述了部分細(xì)胞因子對皮膚物理屏障影響的進展，更多的免疫因子對物理屏障、微生物屏障（如金黃色葡萄球菌）、化學(xué)屏障（如抗菌肽）的影響有待進一步研究。免疫網(wǎng)絡(luò)龐大而錯綜復(fù)雜，很難完全預(yù)測每一細(xì)胞因子在疾病中的單一作用，無論免疫失調(diào)和屏障受損何者為因果，免疫與屏障之間的關(guān)系都值得進一步探究，以便更深入了解AD的發(fā)病機制，探索更有效的治療方法。