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(1.溫州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 溫州 325006； 2.仙居縣農(nóng)業(yè)局)

豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PDEV)引起的以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水為主要臨床特征的一種高度接觸性腸道傳染病[1]。首先于1978 年報(bào)道于英國，確定其是由一種冠狀病毒引起的疾病。目前該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。斷奶豬和成年豬經(jīng)常發(fā)生一過性的腹瀉，而哺乳仔豬，尤其7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬發(fā)生腹瀉并死亡，發(fā)病率高達(dá)100%，病死率平均為50%，最高病死率接近100%，且多數(shù)疫情主要發(fā)生在中小規(guī)模養(yǎng)豬場[3]。

1 材料與方法

1.1發(fā)病仔豬 選取出生7日齡以內(nèi)且腹瀉在12-36 h內(nèi)的活仔豬，確診為流行性腹瀉感染的仔豬，且實(shí)驗(yàn)室檢測排除豬瘟、高致病性藍(lán)耳病毒等其他病原體，病死豬不可用。

1.2健康肉豬 180日齡臨床健康肉豬2頭。

1.3發(fā)病仔豬腸組織返飼材料制備 選擇符合1.1條件的發(fā)病仔豬。集中統(tǒng)一放血致死，不要將污染面擴(kuò)大，剖開腹腔，取出仔豬的胃、小腸和大腸，放入干凈的盆中，盆中放入冰塊保持低溫，在盆中選取需要的組織，在此過程中不能使用任何消毒劑。先剪碎選取小腸和大腸,一頭仔豬的內(nèi)臟加入250 mL預(yù)冷藏的蒸餾奶，不含糖奶。用勻漿機(jī)將加過蒸餾奶的剪碎樣品制成勻漿，注意時間不要超過0.5 min，以免機(jī)器過熱導(dǎo)致病毒死亡。將勻漿乳狀返飼材料分裝，每袋盛裝100 mL，用橡皮筋扎口封嚴(yán)，每袋可喂10～50頭母豬，立即飼喂或-20℃下凍存。每袋盡量一次用完，不能反復(fù)凍融，以免病毒死亡。

1.4發(fā)病仔豬腸組織滅活苗制備 選擇符合1.1條件的發(fā)病仔豬。集中統(tǒng)一放血致死，剖開腹腔，采取整個大小腸段，立即-20 ℃反復(fù)冷凍一次。趁病料未完全解凍前，將其剪碎成1 cm3小塊，注意腸內(nèi)容物的保留。按照1∶3比例，加入冷藏的生理鹽水，制成勻漿。勻漿液用40目濾篩初濾和60目的濾篩二濾。按最終甲醛溶度為0.3%～0.5%劑量，添加甲醛滅活，嚴(yán)格混勻，分裝。37 ℃溫箱滅活48 h，期間每2 h搖勻一次組織滅活苗。細(xì)菌學(xué)檢測：將做好的滅活組織苗無菌操作接種到血平板培養(yǎng)基上，37 ℃生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，觀察有無菌落長出。仔豬安全性檢測：選擇健康的斷奶仔豬2頭，每頭分兩點(diǎn)注射接種滅活組織苗10 mL，連續(xù)觀察7 d，查看有無發(fā)病，同時設(shè)立對照組。

1.5返飼材料與腸組織滅活苗的使用 用制備好的返飼材料飼喂懷孕母豬(孕齡80 d以內(nèi))、后備母豬、斷奶母豬，每頭母豬喂5-10 mL，隔日連喂2-3次；切忌不可喂產(chǎn)房哺乳母豬和孕齡80 d以上的母豬。返飼當(dāng)天全場按順序消毒，尤其母豬定位欄，杜絕返飼材料污染哺乳豬舍等其它場所。

返飼結(jié)束的母豬在間隔開1周、2周、2周分別肌肉注射一次腸組織滅活苗；后備母豬(千萬不能漏打后備母豬和公豬)配種前完成三次免疫：第一次喂返飼材料，第二次和第三次分別肌肉注射發(fā)病仔豬腸組織滅活苗，分別間隔2周。

1.6豬流行性腹瀉高免血清的制備 對180日齡的2頭肉豬進(jìn)行飼喂制備好的返飼材料，每頭10 mL，各間隔1 d，連續(xù)飼喂3次；7 d后肌肉注射發(fā)病仔豬腸組織滅活苗5 mL，各間隔14 d，連續(xù)注射3次。免疫期間，給予自由采食和飲水，并在飲水中添加適量的電解多維，減低應(yīng)激和提高免疫應(yīng)答。

在最后一次肌注組織滅活苗后10 d，經(jīng)頸動脈放血無菌采集肉豬全身血液，玻璃珠等物理方法抗凝血。將收集的抗凝血以3000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心無菌分離血清，分裝，再置入56 ℃水浴中滅活補(bǔ)體30 min，按10 IU/mL劑量分別添加青鏈霉素4 ℃作用12 h，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1返飼效果觀察 通過飼喂返飼材料和肌注滅活苗，以此來逐步的擴(kuò)大母豬的保護(hù)面，以致最后消除PED病毒的威脅[4-5]。母豬在返飼后1周左右可產(chǎn)生抗體，成功的人工感染大約有8%-30%的母豬拉稀，有些母豬不拉稀但精神沉郁，1-2餐不吃食。哺乳仔豬吃到母源抗體后獲得被動免疫，起到保護(hù)作用。

2.2高免血清效果觀察 使用制備的PED高免血清對早中期的發(fā)病仔豬進(jìn)行肌肉注射，每公斤體重注射5 mL，連續(xù)使用3 d；加以配合口服葡萄糖鹽水、慶大霉素和電解多維，能使病死率降低到20%左右。

3 小結(jié)與討論

3.1返飼注意事項(xiàng) 返飼材料取自的發(fā)病仔豬實(shí)驗(yàn)室檢測排除混合感染豬瘟，藍(lán)耳病等疫病，制作過程一定要低溫操作，時間不宜過長，從取樣到分裝持續(xù)時間控制在1 h以內(nèi)，防止操作過程中的外來污染以及消毒劑或其他化學(xué)物質(zhì)對返飼材料的干擾。一般情況下，定位欄母豬飼喂完返飼材料后，及時對定位欄持續(xù)消毒10 d。

3.2仔豬初乳管理 新生仔豬盡早吃到初乳，以免被外界野毒感染。最好轉(zhuǎn)出哺乳能力差的母豬或有乳房炎的母豬并做好治療工作，仔豬最好淘汰或轉(zhuǎn)給剛斷奶的母豬寄養(yǎng)。加強(qiáng)初乳管理，尤其是夜間出生的，初乳攝入量要達(dá)到40 mL/頭，以提高仔豬的被動抵抗力。

3.3隔離發(fā)病母仔 把產(chǎn)房的發(fā)病母豬及嘔吐、腹瀉仔豬迅速轉(zhuǎn)出產(chǎn)房，進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，防止病毒傳播而導(dǎo)致腹瀉所造成的高死亡率。

3.4干燥消毒空欄 對腹瀉母豬的產(chǎn)床及相鄰產(chǎn)床進(jìn)行嚴(yán)格的清理干燥消毒，用消毒藥粉灑在污染物上作用一定時間后沖洗。再實(shí)施消毒和空欄，空欄的時間要足夠，可長達(dá)3-5 d，消毒以火焰消毒效果更佳。