江貴軍，呂菁君

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院急診科,湖北 武漢 430060)

血小板活化在膿毒癥發(fā)生及發(fā)展過程中具有重要作用。在膿毒癥期間，血小板被激活后可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并促使中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(neutrophil extracellular traps，NETs)以及微血栓的形成，加重膿毒癥患者體內(nèi)凝血功能紊亂及炎癥反應(yīng)失調(diào)，最終導(dǎo)致患者發(fā)生多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。另外，在感染時(shí)，血小板還參與機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)及獲得性免疫反應(yīng)過程，通過與免疫介質(zhì)相互作用，血小板在積極防衛(wèi)病原體入侵、擴(kuò)散的同時(shí)，也可能因免疫過度而使病情加重，甚至引起膿毒性休克。本文主要介紹血小板活化在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，同時(shí)重點(diǎn)突出血小板參與的免疫反應(yīng)在機(jī)體感染時(shí)的作用。

1 背景

膿毒癥是指病原體經(jīng)血液播散后引起全身性感染的一類癥候群，神經(jīng)內(nèi)分泌途徑、代謝性途徑及免疫性途徑等共同參與了膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展，其中免疫反應(yīng)失調(diào)是該病的重要病理基礎(chǔ)之一[1-2]。作為一種病理機(jī)制復(fù)雜和病死率較高的疾病，“膿毒癥3.0”將其定義為“宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙”[3]。當(dāng)病原體侵襲機(jī)體時(shí)，凝血系統(tǒng)在感染部位激活以及局部微血管血栓形成均起著防衛(wèi)作用，從而限制感染通過“免疫相關(guān)性血栓形成”進(jìn)一步損傷機(jī)體[4]。局部感染時(shí)，血小板釋放炎癥因子和招募炎癥細(xì)胞，并且黏附在細(xì)菌和上皮細(xì)胞表面，最終形成微血栓，防止感染蔓延，但是在膿毒癥患者體內(nèi)，機(jī)體的這種保護(hù)機(jī)制被過度激活，導(dǎo)致患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)失衡，最終引起MODS[5]。膿毒癥期間，炎癥-凝血反應(yīng)和損傷的內(nèi)皮細(xì)胞都會(huì)引起血小板激活，激活的血小板與炎癥介質(zhì)以及內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用又可以進(jìn)一步加重全身炎癥反應(yīng)和凝血功能異常，從而形成“炎癥-血小板活化-炎癥”的惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的微循環(huán)障礙和器官功能損傷[6]。另外，我們通常只注重血小板在早期止血過程的作用，而忽視了血小板其他方面的功能，近幾年研究[7-10]表明，血小板在免疫反應(yīng)過程中也具有重要作用。血小板在機(jī)體止血和凝血過程中所起的作用毋庸置疑，但在膿毒癥期間，很少發(fā)生因血小板減少而導(dǎo)致出血的情況，這種出血性并發(fā)癥導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的病例相當(dāng)少見，因此研究者們更加關(guān)注血小板在免疫應(yīng)答過程中的作用[11]，血小板參與的免疫應(yīng)答也許是導(dǎo)致膿毒性休克的主要原因[12]。

2 血小板活化在膿毒癥中的作用

2.1 血小板的活化機(jī)制 膿毒癥期間，血小板既可以通過經(jīng)典途徑激活，也可以通過多種特殊通路活化。首先，在經(jīng)典途經(jīng)中，凝血酶、血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)是激活血小板最常見的誘導(dǎo)物，當(dāng)它們與血小板表面的相應(yīng)受體結(jié)合后便開始啟動(dòng)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終引起血小板激活[3,13-14]。在上述三種誘導(dǎo)物中，凝血酶和TXA2是最強(qiáng)效的血小板激活物，它們無需依賴血小板顆粒的分泌作用，而是通過分別與血小板膜上的蛋白酶激活受體及TXA2受體結(jié)合，進(jìn)而直接誘導(dǎo)血小板激活和聚集[13-14]。血小板活化后，其胞質(zhì)內(nèi)的致密顆粒釋放出無機(jī)多磷酸，這種磷酸物質(zhì)可以通過激活凝血因子Ⅻ進(jìn)而激活凝血酶[15]，可見凝血酶與血小板活化之間存在正反饋?zhàn)饔?，促使血液中血小板大量激活。ADP則主要與血小板膜上的G蛋白偶聯(lián)受體P2Y12相結(jié)合，并且高劑量的ADP將誘導(dǎo)血小板顆粒的分泌作用并釋放內(nèi)源性的ADP，從而引起血小板不可逆性的聚集[16]。隨后P2Y12受體與Gi蛋白偶聯(lián)，抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，從而降低細(xì)胞內(nèi)cAMP以及受血管擴(kuò)張劑刺激的磷蛋白的水平，這一反應(yīng)將促進(jìn)血小板表面糖蛋白Ⅱb(glycoprotein Ⅱb，GPⅡb)和血小板表面糖蛋白Ⅲa(glycoprotein Ⅲa，GPⅢa)形成GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物。GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物通過構(gòu)型改變而暴露纖維蛋白原受體的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)血小板-纖維蛋白原復(fù)合體的形成，導(dǎo)致血小板聚集，最終形成牢固的止血栓[17]。膿毒癥期間，除上述經(jīng)典的活化機(jī)制以外，血小板還可以通過其他途徑激活，如血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用就是其中一個(gè)非常重要的機(jī)制。微血管和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是膿毒癥的標(biāo)志之一，隨著內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡，內(nèi)皮下膠原暴露，血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)也從內(nèi)皮細(xì)胞中釋放出來，隨后分別與血小板膜上的糖蛋白受體GPⅥ以及糖蛋白受體GPⅠbα-Ⅸ-Ⅴ結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)血小板的激活[4]。Cognasse等[18]研究顯示，在膿毒癥期間，血小板活化還存在著另一種重要機(jī)制，該過程需要Toll樣受體(toll like-receptors,TLRs)參與完成。此研究證明，TLR2及TLR4表達(dá)于血小板表面，并且充當(dāng)著一種識(shí)別受體，當(dāng)它們與特異性病原菌配體結(jié)合后，便會(huì)激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，從而引起血小板的活化和釋放。

2.2 血小板活化與NETs NETs是存在于中性粒細(xì)胞胞外的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它以DNA為框架，由組蛋白、髓過氧化物酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G以及肌鈣網(wǎng)蛋白等成分相互編織而成[19-20]，組成NETs框架的DNA不僅包括細(xì)胞核來源的DNA，還有小部分來源于線粒體DNA[21]。在膿毒癥期間，細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖會(huì)促使血小板通過TLR2受體與中性粒細(xì)胞黏附在一起，從而促進(jìn)NETs的形成。另外，研究者們還將血小板表面TLR4受抑制的小鼠和白細(xì)胞表面TLR4受抑制的小鼠分別與正常對照組比較，結(jié)果顯示血小板TLR4受抑制的小鼠較正常對照組的NETs水平明顯降低，而白細(xì)胞TLR4受抑制的小鼠較正常對照組無明顯變化，表明血小板表面的TLR4受體對NETs的形成也具有重要的協(xié)同作用[19]。近年研究[13]表明，血小板表面的TLR2及TLR4激活后不僅可以引起血小板的活化和釋放，還可以直接促進(jìn)NETs形成，而血小板在相互聚集后也可以間接促使NETs形成，最終它們共同導(dǎo)致膿毒癥患者靶器官損傷。NETs具有兩面性，一方面，在機(jī)體感染初期，NETs具有殺菌作用，因此它是機(jī)體的一種免疫防衛(wèi)機(jī)制；但另一方面它還參與了包括膿毒癥在內(nèi)的許多疾病的病理過程，并損傷機(jī)體自身的細(xì)胞和組織[22]。NETs對機(jī)體總的影響是由多種因素決定的，其中NETs的持續(xù)性激活，反饋抑制通路障礙以及NETs產(chǎn)生過剩都是其引起器官功能損傷的主要病理機(jī)制。雖然體內(nèi)NETs水平過高也會(huì)影響免疫系統(tǒng)，尤其對獲得性免疫應(yīng)答影響最大，但其在膿毒癥中的致病機(jī)制主要是通過促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)從而引起微循環(huán)損傷和MODS[23]。膿毒癥期間“NET-血小板-血栓”動(dòng)態(tài)軸是導(dǎo)致血管內(nèi)凝血以及微血管功能障礙的重要因素，而抑制NETs的形成可以減輕膿毒癥患者微循環(huán)障礙和MODS[24]。一項(xiàng)小型隊(duì)列研究[25]發(fā)現(xiàn)，在監(jiān)測膿毒性休克患者體內(nèi)NETs水平時(shí)，患者循環(huán)中NETs的水平越高，患者的序貫性器官功能衰竭評分(sequential organ failure assessment,SOFA)也就越高，MODS表現(xiàn)也越明顯，表明NETs的形成與膿毒癥患者病情進(jìn)展密切相關(guān)。值得注意的是，在血小板表面受體中，除上述TLR4和 TLR2受體以外，蛋白酶激活受體、GPⅠbα-Ⅸ-Ⅴ、GPⅡb/Ⅲa和GPⅥ等受體，以及多種細(xì)胞因子或分子物質(zhì)(如P-選擇素、血小板第4因子、 vWF和TXA2)也參與了NETs形成[26]，而這些受體、細(xì)胞因子和分子物質(zhì)都參與了血小板的活化機(jī)制，可見血小板活化與NETs的形成密切相關(guān)。

2.3 血小板活化與炎癥反應(yīng) 血小板活化后釋放出大量具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的因子。如血小板胞質(zhì)中存在著許多致密性顆粒，這種致密顆粒中包含大量的ADP、ATP、鈣離子、腎上腺素及其他分子物質(zhì)[27]，當(dāng)血小板活化時(shí)，這些分子被釋放出來，而釋放出來的這些分子物質(zhì)又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)其他血小板的活化、聚集和分泌作用，最終導(dǎo)致級聯(lián)放大效應(yīng)。此外，這些分子可以招募大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及其他炎癥細(xì)胞，并且促進(jìn)它們的激活和分泌[28]。如血小板活化后其細(xì)胞質(zhì)中α-顆粒會(huì)釋放出血小板第4因子(platelet factor 4, PF4)，這是一種中性粒細(xì)胞趨化因子, 它能夠?qū)⒅行粤＜?xì)胞招募至炎癥部位并加重組織損傷[29]。 Liverani等[30]研究首次證明，在膿毒癥期間，δ-蛋白激酶C(protein kinase C-delta，PKCδ)在血小板活化過程以及血小板-中性粒細(xì)胞相互作用中具有重要作用，研究者們對兩組大鼠分別進(jìn)行假手術(shù)和盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)以誘導(dǎo)膿毒癥，手術(shù)完成后，分別在兩組大鼠氣管內(nèi)給予PKCδ抑制劑，并在手術(shù)后24 h收集兩組大鼠的肺組織、支氣管肺泡灌洗液和血液標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血小板PKCδ的活性增加會(huì)促使血小板活化，而抑制PKCδ的活性可以減弱膿毒癥誘導(dǎo)的血小板活化、分泌和聚集，并且使用PKCδ抑制劑可降低血小板減少癥的發(fā)生，另外PKCδ抑制劑還可以抑制局部和全身血小板活性，減少中性粒細(xì)胞從血液向肺組織滲透，進(jìn)而減輕膿毒癥引起的肺損傷。通過監(jiān)測膿毒癥大鼠體內(nèi)PF4水平，研究者們還發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠在血漿和支氣管肺泡灌洗液中的PF4水平與正常對照組相比明顯升高。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，缺乏PF4的小鼠在發(fā)生急性肺損傷時(shí)，其肺功能下降并不明顯，而正常小鼠在發(fā)生急性肺損傷后肺功能明顯下降[31]，說明PF4是加重肺損傷的重要因素。另外，PF4還可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的黏附、脫顆粒、趨化及吞噬作用，并引起白細(xì)胞內(nèi)活性氧蓄積，最終導(dǎo)致內(nèi)皮損傷[32]。此外，活化后的血小板會(huì)在其表面表達(dá)P-選擇素，隨后P-選擇素再與中性粒細(xì)胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1結(jié)合，從而促使中性粒細(xì)胞趨向并黏附于血管內(nèi)皮上，加重血管內(nèi)皮的損傷[33]。然而，Claushuis等[34]研究表明，在肺炎所致的膿毒癥中，血小板表面的糖蛋白受體GPⅥ在肺炎克雷伯菌及其毒素刺激下被激活，隨后通過促進(jìn)白細(xì)胞活化及血小板-白細(xì)胞復(fù)合物的形成，增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬作用，進(jìn)而促進(jìn)膿毒癥期間的局部宿主防御?？梢娧“鍏⑴c的炎癥反應(yīng)在感染初期可以限制感染的擴(kuò)散，是宿主自身的一種防御機(jī)制，但隨著感染的加重和炎癥介質(zhì)釋放的增多，血小板被大量激活，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失衡，引起全身炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)微循環(huán)障礙和組織器官的損傷。

3 血小板相關(guān)免疫反應(yīng)在膿毒癥中的作用

3.1 血小板與先天性免疫反應(yīng) 盡管通常認(rèn)為止血和血栓形成才是血小板最主要的功能，但其實(shí)血小板還具有許多其他的功能，其中最重要的就是免疫功能。如除在凝血塊的形成過程中起重要作用外，血小板在損傷部位和炎癥組織中被激活后，還可以防止?jié)撛诓≡w的入侵，充當(dāng)?shù)谝坏婪烙鶛C(jī)制[35]。血小板作為一線細(xì)胞被招募到炎癥和感染部位，并且在啟動(dòng)血管內(nèi)免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[32]。此外，血小板還可以通過釋放抗微生物介質(zhì)、物理誘捕、包圍入侵菌等手段直接對抗病原菌，從而防止病原菌通過血流播散[35-36]。 研究[7-8]表明，血小板能夠協(xié)調(diào)招募各種各樣的免疫細(xì)胞，并指導(dǎo)它們的效應(yīng)程序，而且血小板發(fā)揮這種功能通常需要以形成緊密的血小板-病原體捆綁復(fù)合物為前提?？梢姡h(huán)中的血小板具有巡邏并識(shí)別病原體的作用，一旦發(fā)現(xiàn)病原體入侵，血小板會(huì)與病原體捆綁在一起，并把具有吞噬作用的細(xì)胞招募過來，使其在感染播散之前將病原菌吞噬分解，從而提高機(jī)體的整體免疫力。Gaertner等[37]發(fā)現(xiàn)，在微速攝影顯微鏡下觀察，循環(huán)中的多核中性粒細(xì)胞在遇到血小板-病原體捆綁復(fù)合物時(shí)會(huì)停留下來，在血小板的協(xié)助下拘禁并吞噬入侵血液的病原體。如在肝中，肝微血管內(nèi)的血小板可以巡查并識(shí)別病菌，并將識(shí)別到的病原菌牢牢地捆綁在表面，與此同時(shí)，血小板還提供中性粒細(xì)胞黏附結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)中性粒細(xì)胞通過該黏附位點(diǎn)與血小板結(jié)合后，便可以將血小板捆綁的病菌吞噬分解[7]。血小板這一功能不僅顯著地促進(jìn)了中性粒細(xì)胞的活化，還將引起NETs的形成，在機(jī)體產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)之前抵抗外來病原體的侵襲?？傊?，血小板在機(jī)體先天性免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

3.2 血小板與獲得性免疫反應(yīng) 當(dāng)膿毒癥患者血液中的特異性抗體識(shí)別出微生物攜帶的抗原或其釋放的毒素后，便會(huì)與之結(jié)合，形成循環(huán)免疫復(fù)合物(immune complexes,IC)，而IC與細(xì)胞免疫之間的病理聯(lián)系需要通過FcγRIIA 受體介導(dǎo)完成，F(xiàn)cγRIIA 受體是唯一由人類血小板表達(dá)的一種Fcγ受體，其親和力比較低，也是血液中表達(dá)最為豐富的Fcγ受體[9]。研究[38-39]證明，轉(zhuǎn)基因小鼠血液中的FcγRIIA受體興奮后可以導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)休克反應(yīng)，這種休克反應(yīng)的發(fā)生與體內(nèi)中性粒細(xì)胞的活化及血小板活化因子的釋放密切相關(guān)。Duerschmied等[10]研究證實(shí)，在無血管損傷的情況下，IC誘導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)同樣可以引起血小板活化。該研究不僅明確了血小板活化在細(xì)胞免疫過程的重要作用，還證實(shí)了從血小板顆粒中釋放的血清素參與了膿毒性休克的發(fā)病機(jī)制，研究者們甚至認(rèn)為血小板釋放的血清素比活化的中性粒細(xì)胞更早促進(jìn)休克反應(yīng)，與早些年所報(bào)道[40]的血清素具有激活中性粒細(xì)胞的作用是一致的，因?yàn)樵谥行粤＜?xì)胞被激活之前，血小板釋放的血清素或許就已經(jīng)啟動(dòng)了休克反應(yīng)機(jī)制。此外，最近有研究[12]發(fā)現(xiàn)，在機(jī)體發(fā)生膿毒性休克時(shí)，血小板會(huì)向肺部及大腦遷移，隨后在微血管中停留下來并完成脫顆粒作用，但在脫顆粒后血小板又會(huì)重新回到循環(huán)中去，這意味著在涉及抗體的獲得性免疫反應(yīng)中，血小板的壽命比我們所預(yù)料的更長，推翻了之前的研究[41-43]結(jié)論，過去我們一直認(rèn)為血小板在脫顆粒后便會(huì)被立即清除，但事實(shí)卻并非如此?？偠灾?，研究者們已證實(shí)血小板在IC相關(guān)性全身炎癥反應(yīng)過程中具有重要地位，并且FcγRIIA信號肽以及血清素的釋放在此類炎癥反應(yīng)中起主導(dǎo)作用[44],因此，血小板所參與的獲得性免疫反應(yīng)也許是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)展及膿毒性休克發(fā)生的重要原因。

4 總結(jié)

作為一種機(jī)制復(fù)雜、發(fā)病率及病死率較高的感染性疾病，膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展涉及到多個(gè)系統(tǒng)的功能障礙，尤其以血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)最為突出，而血小板的激活幾乎是引起各系統(tǒng)功能障礙的導(dǎo)火索。膿毒癥期間，血小板活化后將發(fā)揮雙重作用，一方面，活化的血小板可以通過激活凝血系統(tǒng)以及參與適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)和免疫應(yīng)答來限制病原體在血液中播散，并協(xié)助吞噬細(xì)胞將病原體吞噬分解[7-8,35-37]；另一方面，血小板活化后也可以通過多種途徑引起凝血功能紊亂、炎癥反應(yīng)失衡和免疫反應(yīng)過度，進(jìn)而加重患者器官功能損傷，最終導(dǎo)致MODS及膿毒性休克[23,38-39]。基于研究者們近年來在膿毒癥發(fā)病機(jī)制方面的研究成果，我們可以從新的角度去探索膿毒癥患者的治療方法：(1)是否可以通過抑制血小板活化逆轉(zhuǎn)失控的宿主反應(yīng)。在膿毒癥動(dòng)物模型中，抗血小板藥物能夠顯著減輕全身炎癥反應(yīng)以及膿毒癥引起的肺損傷[45]。在膿毒癥患者中，那些使用了抗血小板藥物(如阿司匹林)的患者預(yù)后明顯改善，原因是抗血小板藥物不僅可以抑制血小板的活化和聚集，改善循環(huán)高凝狀態(tài)，還可以發(fā)揮抗炎和抑制NETs形成的作用[46]。另外，抗血小板藥物還可以降低C反應(yīng)蛋白、P-選擇素以及血小板-白細(xì)胞聚合物，有利于膿毒癥的預(yù)防和治療[47]。因此，抑制血小板的活化將有可能成為治療膿毒癥的關(guān)鍵[48]。(2)是否可以通過抑制PF4的活性，從而減弱膿毒癥誘導(dǎo)的血小板活化、分泌和聚集，緩解膿毒癥患者全身性炎癥反應(yīng)并糾正凝血功能紊亂，減輕因中性粒細(xì)胞從血液滲入肺組織而引起的肺損傷。Lord等[49]研究證實(shí)，與基底膜聚糖、絲甘蛋白聚糖或肝素等分子進(jìn)行預(yù)孵育處理后的PF4可以抑制正常PF4介導(dǎo)的血小板活化作用，并且PF4對硫酸乙酰肝素的親和力更高，對血小板活化的抑制能力更強(qiáng)。因此，研究出可用于臨床的PF4拮抗藥和外源性硫酸乙酰肝素制劑將有利于膿毒癥的治療。(3)是否可以通過阻斷IC與血小板表面的FcγRIIA結(jié)合，進(jìn)而減輕免疫反應(yīng)過度引起的組織器官損傷。Yeung等[50]研究首次證實(shí)了血小板型12-脂氧合酶(platelet 12-lipoxygenase, p12-LOX)是FcγRIIA免疫介導(dǎo)血小板活化過程中的重要環(huán)節(jié)，并且p12-LOX的抑制劑能顯著抑制FcγRIIA介導(dǎo)的血小板活化作用。因此，研究出適用于臨床的FcγRIIA抑制劑或p12-LOX抑制劑都將使膿毒癥患者獲益。隨著對膿毒癥發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，未來一定可以找到更好的方法控制膿毒癥的進(jìn)展，最終改善膿毒癥患者的預(yù)后。