張薇薇，Donna E. Goldhawk，李海龍

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)影像教研室，4.臨床診斷檢驗(yàn)教研室，5.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000；2.羅森健康研究所醫(yī)學(xué)影像項(xiàng)目組，安大略 倫敦 N6A 5C1；3.西安大略大學(xué)醫(yī)學(xué)生物物理學(xué)系，安大略 倫敦 N6A 4V2)

報(bào)告基因指在細(xì)胞、組織或器官處于特定情況下編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的一類(lèi)基因，其表達(dá)產(chǎn)物易于檢測(cè)。這一概念起源于20世紀(jì)80年代[1]，而將報(bào)告基因與MRI結(jié)合起來(lái)的研究可追溯至20世紀(jì)90年代[2]。最早的受體靶向MRI對(duì)比劑采用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor， TfR)，之后Weissleder等[3]提出利用MRI監(jiān)測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)信息技術(shù)，使得MRI報(bào)告基因的研究越來(lái)越受到關(guān)注。磁小體由趨磁細(xì)菌經(jīng)過(guò)生物礦化而形成，是1種由基因調(diào)控而成的磁性納米顆粒，受生長(zhǎng)環(huán)境影響，其核心成分主要是磁鐵礦(Fe3O4)或膠黃鐵礦(Fe3S4)；與人工合成的磁性Fe3O4納米顆粒相比，其最大特點(diǎn)是自帶天然形成的磷脂雙層生物膜結(jié)構(gòu)。磁小體具有穩(wěn)定的單磁疇結(jié)構(gòu)、室溫下永久磁性、化學(xué)純度高、粒徑均一、晶體形態(tài)一致等特點(diǎn)。此外，磁小體的合成由1組特定基因控制[4]。以上諸多特性使磁小體顯示出巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用和商業(yè)化潛力。本文從MRI報(bào)告基因應(yīng)用角度，對(duì)磁小體及其相關(guān)基因作為新型生物材料在分子影像學(xué)方面的研究進(jìn)行綜述。

1 磁小體的分子影像學(xué)應(yīng)用

目前已在數(shù)種細(xì)胞模型中證實(shí)了磁小體的潛在MR對(duì)比劑用途，包括胰腺細(xì)胞[5]、腦細(xì)胞[6]及異種移植腫瘤細(xì)胞[7]，相關(guān)研究正在引起極大關(guān)注。

1.1 磁小體在腫瘤靶向MRI中的應(yīng)用 有學(xué)者[7]運(yùn)用組合化學(xué)(one-bead-one-compound， OBOC)技術(shù)，成功篩選出靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor， EGFR)和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2， HER2)的新肽P75，該肽可對(duì)自野生型趨磁細(xì)菌MSR-1菌株中提取的磁小體進(jìn)行表面修飾，形成Mag-P75，用于腫瘤靶向MR成像；體外和體內(nèi)熒光成像結(jié)果表明，Mag-P75可特異性結(jié)合人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468，在腫瘤模型內(nèi)顯示出明顯負(fù)對(duì)比增強(qiáng)，提示Mag-P75在MR靶向診斷EGFR和HER2陽(yáng)性腫瘤中具有較高敏感度，可以作為T(mén)2加權(quán)對(duì)比劑。此外，該研究[7]還發(fā)現(xiàn)肽功能化磁小體具有診斷、治療和監(jiān)測(cè)腫瘤的多功能納米粒子的潛力。Alphandéry等[8]使用磁小體鏈，在交變磁場(chǎng)作用下對(duì)小鼠顱內(nèi)U87-Luc膠質(zhì)瘤行磁熱療，導(dǎo)致病灶完全消失，表明在交變磁場(chǎng)作用下，從磁小體鏈中釋放內(nèi)毒素的量可控制，提示此為導(dǎo)致腫瘤破壞的機(jī)制之一。Erdal等[9]對(duì)磁小體與超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide， SPIO)靶向乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的比較研究顯示，人血清白蛋白(human serum albumin， HSA)包被的SPIO(HSA-SPIONs)與磁小體均可與熒光標(biāo)記的抗EGFR抗體化學(xué)綴合。濃度為250 μg/ml的磁小體與MDA-MB-231細(xì)胞的結(jié)合率為92.0%±0.2%，而250 μg/ml的HSA-SPIONs顆粒結(jié)合率則為65.0%±5.0%；在腫瘤組織中，抗EGFR修飾后的磁小體比HSA-SPIONs顆粒具有更高的T2WI信號(hào)。此外，利用磁共生體(magneto-endosymbionts， MEs)技術(shù)，已經(jīng)推出了商業(yè)化的細(xì)胞標(biāo)記試劑盒，被用作基于磁鐵礦的MRI對(duì)比劑來(lái)示蹤細(xì)胞，其增強(qiáng)T2、T2*對(duì)比度的作用在體內(nèi)更具優(yōu)勢(shì)[10]。

1.2 磁小體在磁性粒子成像(magnetic particle imaging， MPI)中的應(yīng)用 極低劑量的磁小體即可被高磁場(chǎng)MR探測(cè)出，磁小體的高敏感度使其在對(duì)比劑領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。Kraupner等[11]將磁小體作為磁性示蹤材料用于MPI，并與商用示蹤劑Resovist?的分辨率進(jìn)行比較，結(jié)果表明磁小體明顯優(yōu)于后者。在17.2T磁場(chǎng)下，Mériaux等[12]比較趨磁細(xì)菌MV-1、AMB-1菌株中提取的磁小體與已商業(yè)化的MRI對(duì)比劑Ferumoxide的弛豫率，發(fā)現(xiàn)2種磁小體的橫向弛豫率均高于Ferumoxide，而由MV-1提取的磁小體的橫向弛豫率最高，約為Ferumoxide的4倍；筆者隨后分別將100 μl生理血清、Ferumoxide及MV-1中提取的純化磁小體注入小鼠腦血管并進(jìn)行三維血管造影成像，發(fā)現(xiàn)MV-1磁小體使檢測(cè)到的體素信號(hào)提高約20%。

雖然用普通培養(yǎng)方法生成的磁小體產(chǎn)量有限，磁小體的分離、純化成本較高，但不斷改進(jìn)方法[13]后，這些問(wèn)題逐漸得到改善?；诖判◇w天然包膜的存在，目前普遍認(rèn)為利用各種化學(xué)手段、蛋白融合技術(shù)修飾磁小體表面具有可行性，對(duì)于磁小體體外仿生[4]、磁小體在腫瘤診斷、磁熱療及調(diào)控腫瘤微環(huán)境乃至制備腫瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)的研究將會(huì)進(jìn)一步深入。

2 磁小體相關(guān)基因在MRI報(bào)告基因中的應(yīng)用

2.1 磁小體生物礦化相關(guān)基因 對(duì)趨磁細(xì)菌AMB-1和MSR-1的系統(tǒng)發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)磁小體生物礦化包括4個(gè)步驟[14]：①磁小體膜(magnetosome membrane，mam)從細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷，形成囊泡樣永久內(nèi)陷或分離的囊泡；②在內(nèi)陷前或后，磁小體蛋白被分選到mam；③鐵被轉(zhuǎn)移到磁小體囊泡中，并被礦化為磁鐵礦晶體；④組裝并定位磁小體鏈，以在細(xì)胞分裂期間分離。迄今已有50多種編碼磁小體相關(guān)蛋白的基因通過(guò)鑒定[14]。磁小體生物礦化特定功能均與1組約30個(gè)聚集在單個(gè)染色體區(qū)域的基因有關(guān)，稱(chēng)之為基因組磁小體島(magnetosome island， MAI)，包含mam基因和磁性粒子-膜特異性(magnetic particle-membrane specific， mms)基因。有研究[15]將mam、mms等相關(guān)基因用于MRI報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)其在分子影像學(xué)中的表現(xiàn)較提取分離出的磁小體更好。

2.2 MagA基因在MRI報(bào)告基因中的應(yīng)用 成功分離MagA基因后[16]，進(jìn)一步明確了MagA與鐵調(diào)控的關(guān)系[17-18]。雖然其后趨磁細(xì)菌MSR-1菌株未能檢測(cè)到MagA[19]，且MagA位于MAI外[20]，但近年來(lái)針對(duì)MagA基因的相關(guān)分子影像學(xué)研究[21]顯示，MagA基因賦予哺乳動(dòng)物細(xì)胞磁性，是一種候選MRI報(bào)告基因。

MagA在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2A細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)磁小體樣顆粒聚集[21]，MagA活性對(duì)鐵補(bǔ)充有反應(yīng)，細(xì)胞MRI對(duì)比度也因此增強(qiáng)，從而有助于進(jìn)行非侵入性細(xì)胞內(nèi)MR成像；且MagA無(wú)細(xì)胞毒性，同時(shí)還能調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)，但該基因可能不受哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體-鐵蛋白軸的鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。進(jìn)一步優(yōu)化MR弛豫率測(cè)量方法后，研究[22]表明由MagA表達(dá)的磁小體樣顆粒較人重鏈和輕鏈鐵蛋白亞基表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白具有更高的MRI信噪比。此外，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染可建立攜帶四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)Tet-On的Tet-MagA小鼠胚胎干細(xì)胞系mESC-MagA，且可通過(guò)含有和不含MagA的小鼠胚胎干細(xì)胞系(mESC-MagA和mESC-WT)來(lái)評(píng)估移植小鼠在小鼠胚胎干細(xì)胞系中表達(dá)MagA的影響[23]。一項(xiàng)7.0T MR掃描儀在監(jiān)測(cè)體內(nèi)具有強(qiáng)力霉素Dox誘導(dǎo)表達(dá)和非誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞及動(dòng)物模型顱內(nèi)成像研究[23]顯示，mESC-MagA可導(dǎo)致T2WI和磁敏感加權(quán)圖像信號(hào)顯著變化。

Guan等[24]制備了用于MRI的MagA轉(zhuǎn)基因小鼠，并評(píng)估其抗氧化酶、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)鐵超負(fù)荷后，與野生型小鼠相比，MagA轉(zhuǎn)基因小鼠較少發(fā)生氧化應(yīng)激水平的明顯變化，也未表現(xiàn)出明顯病理癥狀或組織學(xué)變化；在MRI信號(hào)方面，MagA過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致橫向弛豫率(R2)改變，MRI可檢測(cè)到鐵過(guò)載小鼠R2中的轉(zhuǎn)基因依賴(lài)性變化。有學(xué)者[25]利用MagA轉(zhuǎn)基因小鼠評(píng)估間充質(zhì)干細(xì)胞中鐵超負(fù)荷和迅速鐵螯合療法是否可以同時(shí)增加MRI檢測(cè)鐵的敏感度，并減弱對(duì)造血微環(huán)境的氧化損傷，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組細(xì)胞相比，在鐵補(bǔ)充劑存在下，間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)MagA的R2*更高；與野生型小鼠相比，來(lái)自鐵過(guò)載MagA轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟的R2*值高；此外，MagA有助于降低鐵對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞毒性，降低p-p38絲裂原活化蛋白激酶和鐵蛋白的表達(dá)，并減少鐵過(guò)載引起的成骨分化抑制作用。

Pereira等[26]重新觀察從趨磁細(xì)菌MS-1菌株分離出來(lái)的MagA作為MRI報(bào)告基因的功效,發(fā)現(xiàn)人胚胎腎細(xì)胞HEK耐受MS-1 MagA基因的組成型表達(dá)，但在小鼠間充質(zhì)/基質(zhì)細(xì)胞和腎源性干細(xì)胞中誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的毒性作用，嚴(yán)重限制MS-1 MagA基因作為干細(xì)胞報(bào)告基因的有效使用;該研究還指出，盡管有人提出MS-1 MagA參與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，但當(dāng)其在HEK細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，不會(huì)影響與鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄；MagA誘導(dǎo)的HEK細(xì)胞中鐵攝取的信號(hào)增強(qiáng)微不足道，表明即使對(duì)于能夠耐受其表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型，該基因也是差的報(bào)告基因，即MagA作為報(bào)告基因須謹(jǐn)慎使用，且其功效因細(xì)胞種類(lèi)不同而異，特別是用于與再生療法相關(guān)的細(xì)胞時(shí)；此外，盡管癌細(xì)胞能耐受其表達(dá)，但必須注意確保其不會(huì)影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。還有研究[20]指出，過(guò)量表達(dá)MagA細(xì)胞中的電子密集斑點(diǎn)實(shí)際上是鐵蛋白聚集體，而非磁小體納米顆粒本身。

2.3 mms6基因在MRI報(bào)告基因中的應(yīng)用 mms6基因是MAI基因之一，與磁小體顆粒的合成、大小和分布密切相關(guān)。除在微生物學(xué)方面外，對(duì)該基因的研究還涉及綠色仿生納米粒子[27]。近期有學(xué)者[28]利用mms6基因進(jìn)行MRI報(bào)告基因研究，其將mms6融合至鼠h-鐵蛋白的C-末端蛋白，作為新的嵌合磁性鐵蛋白報(bào)告基因，使得鐵蛋白生物礦化并使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞R2增強(qiáng)；即使在沒(méi)有外源性鐵補(bǔ)充的情況下，表達(dá)mms6的腫瘤也能與不表達(dá)mms6的親代腫瘤區(qū)分開(kāi)，但其潛在細(xì)胞毒性問(wèn)題尚待澄清，mms6是否是一種有效遺傳MRI報(bào)告基因有待確定。

2.4 其他磁小體相關(guān)基因 鑒于已鑒定了50多種編碼磁小體相關(guān)蛋白的基因，該領(lǐng)域研究將有很大發(fā)展空間。相信對(duì)磁小體mamI和mamL基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的研究[29]將會(huì)取得進(jìn)一步成果。

3 展望

報(bào)告基因是分子工程的工具，可評(píng)估活細(xì)胞和整個(gè)生物體內(nèi)特定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的位置、持續(xù)時(shí)間和程度。磁小體基因敲除研究[30]提出了1種可能性，即部分基因可用于在多種細(xì)胞類(lèi)型中產(chǎn)生最小區(qū)室，允許鐵生物礦化用于非侵入性MR醫(yī)學(xué)成像。利用將磁小體生物礦化相關(guān)基因轉(zhuǎn)移到其他微生物的能力，很可能實(shí)現(xiàn)以更經(jīng)濟(jì)的方法生產(chǎn)、純化磁小體，促進(jìn)磁小體在生物技術(shù)和納米技術(shù)中的應(yīng)用。生物安全性、細(xì)胞毒性是磁小體和磁小體相關(guān)基因利用過(guò)程中必須關(guān)注的問(wèn)題，將是今后的研究方向之一。

總之，新的基因組學(xué)技術(shù)正在影響著醫(yī)學(xué)的每一個(gè)領(lǐng)域?；蚪M學(xué)和影像學(xué)的發(fā)展和結(jié)合誕生了一門(mén)新的學(xué)科——影像遺傳學(xué)。磁小體及其相關(guān)基因的研究為MRI生物醫(yī)學(xué)成像提供了新的可能性。未來(lái)相關(guān)領(lǐng)域的研究工作將會(huì)面臨很多挑戰(zhàn)，同時(shí)也為診治疾病帶來(lái)更多機(jī)遇。