何方, 師希雄＊,岳建偉,余群力，王鵬燕,高振艷,陳顥予,岳瑤

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070

引言

牦牛是以青藏高原為中心，毗鄰高山、亞高山高寒地區(qū)的特有畜種，我國(guó)是世界上牦牛數(shù)量和品種最多的國(guó)家[1-2]。牦牛肉不僅蛋白質(zhì)與氨基酸含量高，脂肪含量低, 而且無(wú)農(nóng)藥殘留[3]，是一種天然的綠色食品，但與其他肉類相比，嫩度較差[4]。目前，國(guó)內(nèi)外研究表明，宰后成熟過(guò)程中肉的嫩化主要?dú)w結(jié)于肌原纖維蛋白的降解[5-6]，所以肌原纖維蛋白與肉的嫩度緊密相關(guān)。ROS是需氧細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，包括超氧自由基(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥自由基(-OH)等[7]。線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)腔钚匝醍a(chǎn)生的最主要來(lái)源[8]，活性氧一方面通過(guò)修飾蛋白質(zhì)骨架肽鏈及氨基酸的側(cè)鏈來(lái)改變蛋白的交聯(lián)或降解狀況，影響蛋白質(zhì)的溶解性、疏水性、持水力、凝膠特性等理化性質(zhì)，進(jìn)一步?jīng)Q定著肉的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、色澤等消費(fèi)品質(zhì)以及蛋白質(zhì)的組成、體外消化率等營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。另一方面，ROS也可以間接介導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，主要是通過(guò)介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化和加速非酶糖基化生成活性羰基化合類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)糖基化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的交聯(lián)，再利用其活性中間產(chǎn)物間接介導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，使正常蛋白的活性增強(qiáng)或減弱[9]，因此，ROS可能影響宰后肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白的降解。目前關(guān)于蛋白質(zhì)氧化在肉品加工領(lǐng)域頗具爭(zhēng)論，Sumder[10]認(rèn)為活性氧在肉的成熟過(guò)程中會(huì)促進(jìn)肌原纖維降解，增加肉的嫩度，張玉林[9]認(rèn)為活性氧在肉的成熟過(guò)程中會(huì)抑制肌原纖維降解，不利于肉的嫩化。ROS對(duì)細(xì)胞凋亡酶還有一定作用，Caspase本身是以非活化的狀態(tài)存在，但是當(dāng)有ATP產(chǎn)生時(shí)會(huì)首先活化起始酶，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活效應(yīng)酶[11]，細(xì)胞凋亡酶系中Caspase-9和Caspase-3分別屬于起始酶和效應(yīng)酶，效應(yīng)酶Caspase-3作用于肌原纖維蛋白，使肌原纖維降解，達(dá)到嫩化的目的[12]?？傊琑OS對(duì)肌原纖維蛋白的影響報(bào)道不一致，而且關(guān)于牦牛肉的研究鮮有報(bào)道。因此，有必要深入研究牦牛肉宰后成熟過(guò)程中ROS細(xì)胞凋亡酶活性及肌原纖維蛋白的影響，為牦牛肉成熟工藝的改進(jìn)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

甘南牦牛，甘肅清河源清真食品股份有限公司，隨機(jī)選取5頭自然放牧，健康無(wú)病36月齡的牦牛，采用伊斯蘭教屠宰方式屠宰后，立即從半胴體上取背最長(zhǎng)肌(Longissimus Dorsi，LD)

1.1.2 試劑

30%的過(guò)氧化氫（H2O2）、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）、氯化鈉（NaCl）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、蔗糖、磷酸鈉（Na3PO4）、氯化鎂（MgCl2）、五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）、氫氧化鈉（NaOH）、酒石酸鉀鈉、氯化鉀（KCl）、磷酸鉀（K3PO4）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化氫（HCl）、疊氮化鈉（NaN3）等均為國(guó)產(chǎn)分析純，活性氧熒光探針DCFH-DA（美國(guó)sigma公司）、caspase-3/-9檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶公司）

1.1.3 儀器

XHF-D高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、TGL-24MC高速冷凍離心機(jī)（湖南平凡科技有限公司）、SP-756P型紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）、FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）

1.2 樣品處理

將取下的背最長(zhǎng)肌，快速取約100g肉樣放入液氮中作為0h樣品。其余肉樣迅速切成體積均勻的肉塊（約50 g/塊），隨機(jī)分成兩組，第一組不做任何處理，第二組樣品浸泡于10mmol H2O2溶液（肉樣：處理液=10∶1），兩組樣品分別置于0～4℃條件成熟0、6、12、24、72、120、168 h，將肉樣在設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)采集并用液氮迅速冷凍后置于-80℃凍藏，用于測(cè)定Caspase-3活性、Caspase-9活性、肌原纖維蛋白溶解性、MFI、可溶性蛋白含量的測(cè)定等指標(biāo)。

1.2.1 ROS相對(duì)含量的測(cè)定

ROS相對(duì)含量的測(cè)定參考Lee等[13]與張玉林等[9]的方法稍加改進(jìn)：將2g不帶肌腱、脂肪的肉放入12mL的Tri-HCl緩沖液（10 mmol/L Tri-HCl，0.8%(m/V) NaCl，0.1mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L sucrose，pH 7.4）中剪碎，在冰浴中勻漿1min，3000g冷凍離心15min收集上清，采用雙縮脲法測(cè)定上清蛋白濃度，并取將上清液與反應(yīng)緩沖液（10mmol/L Tris-HCl，0.8%(m/V) NaCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10mmol/L sucrose，10 μmol/L DCFH-DA，pH 7.4）按1∶1的比例混合，孵育（37℃，15min）后4℃，12000 g條件下離心8 min，并迅速用熒光分光光度分別計(jì)測(cè)定（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm）熒光值。

1.2.2 Caspase-3、9活性的測(cè)定

按照Caspase-3和Caspase-9活性試劑盒上的測(cè)定方法測(cè)定。

1.2.3 肌原纖維蛋白溶解性

肌原纖維蛋白的提取：肌原纖維蛋白的提取方法參考王宇[14]的方法并進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。肌原纖維蛋白的提取在4℃下進(jìn)行，取2g絞碎的肉樣品加入8ml緩沖液（10 mmol/L Na3PO4，0.1mol/LNaCl，2mmol/LMgCl2和1mmol/L EDTA，pH 7.0），勻漿60s后，在4℃下6000r/min離心15min，取沉淀重復(fù)上述步驟2次，得到粗提肌原纖維蛋白。取此沉淀加入4倍體積的0.1mol/L NaCl溶液，勻漿60s，6000r/min冷凍（4℃）離心15min，重復(fù)此操作1遍，取此沉淀加入4倍體積的0.1mol/L NaCl溶液，勻漿60s，4層紗布過(guò)濾，取濾液，用0.1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0，6000r/min冷凍（4℃）離心15min，沉淀即為提純的肌原纖維蛋白，4℃冷藏備用。

溶解性的測(cè)定在kingsley等[15]的方法上做了一些調(diào)整，肌原纖維蛋白1g，溶于50mL濃度為0.75%的NaCl溶液中，用0.1mol/L的氫氧化鈉或0.1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0（偏離等電點(diǎn)5.5即可），再在60℃水浴鍋加熱30min，之后6000r/min冷凍（4℃）離心15min取上清液，采用雙縮脲法測(cè)定離心前后上清液中蛋白質(zhì)含量，按下式計(jì)算：

肌原纖維蛋白溶解性（%）=上清液蛋白質(zhì)含量/樣品中總蛋白質(zhì)含量× 100%

1.2.4 MFI

參照DelgadoE.F.等[16]的研究方法，取2g肉樣，用20mL的MFI緩沖液（100mmol/L的KCl、20mmol/L Na3PO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L MgCl2、1mmol/L NaN3，pH 7.1），將肉樣機(jī)械冰浴勻漿后。所得懸濁液在1000g離心15min，棄去上清液，沉淀再用20mL的MFI緩沖液使之重新處于懸濁態(tài)，再于1000g離心15min，棄去上清液。沉淀用10mL的MFI緩沖液使之重新處于懸濁態(tài)，用200目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾該懸濁液，另用10 ml的MFI緩沖液幫助肌原纖維蛋白通過(guò)濾網(wǎng)，過(guò)濾所得的肌原纖維蛋白懸濁液用雙縮脲法測(cè)定其蛋白含量。

計(jì)算：用緩沖液調(diào)整懸浮液調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白液的最終濃度為0.5mg/ml（MFI緩沖液加入6ml，根據(jù)測(cè)得蛋白含量計(jì)算所需蛋白體積），再用分光光度計(jì)測(cè)定（540nm處）吸光值，將所得結(jié)果（吸光值）乘以200后即為MFI值。

1.2.5 肌原纖維蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

參考孫圳等[17]的方法，取背最長(zhǎng)肌，剔除可見(jiàn)脂肪和結(jié)締組織，按樣品（g）與提取液（0.1mol/L NaCl，10mmol/L Na3PO4，2mmol/L MgCl2，2mmol/L EGTA，pH 7.0）1∶4（W/V）的比例加入，于組織搗碎機(jī)中充分?jǐn)匕杌靹?，得到均勻的肉糜混合液；形成的肉漿離心（2000g，15min，4℃），取其沉淀；在相同條件再洗滌、繼續(xù)離心兩次，用紗布過(guò)濾除去肌膜及脂肪組織等；隨后用4倍體積（V/W）的0.1mol/L NaCl溶液洗滌、離心兩次（2000g，15min，4℃），得到肌原纖維蛋白，將其冷凍干燥后存于抗氧化劑及其干燥劑中，用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定二級(jí)結(jié)構(gòu)并利用PeakFit 4.12軟件擬合并計(jì)算各個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)百分比。

2.結(jié)果與分析

2.1 H2O2對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中ROS生成量的影響4.2 測(cè)試方法

圖1 H2O2 對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中ROS生成量的影響（A、B代表在同一時(shí)間點(diǎn)兩組之間差異顯著）Figure 1 changes in relative content of ROS after natural maturity and H2O2 soaking during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

由圖1可知，牦牛肉成熟過(guò)程中，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組與對(duì)照組ROS相對(duì)含量均呈現(xiàn)先下降再上升再下降的趨勢(shì)，且對(duì)照組和試驗(yàn)組均在5d時(shí)達(dá)到最高值，但0.5-8d試驗(yàn)組ROS含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。H2O2作為自由基的一員，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝[9]，本研究中H2O2組ROS相對(duì)含量明顯高于對(duì)照組，這與張玉林等[9]研究結(jié)果類似。

2.2 ROS對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中 Caspase-3與Caspase-9活性的影響

圖2 ROS對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中 Caspase-3/9活性的影響（A、B代表在同一時(shí)間點(diǎn)兩組之間差異顯著）Figure 2 Effect of ROS on caspase-3/9activity during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

由圖2A可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，0.5-3d試驗(yàn)組與對(duì)照組Caspase-3酶活性呈現(xiàn)先降低再升高再降低的趨勢(shì)，0.5d時(shí)Caspase-3酶活性最低，3d時(shí)最高，且0.5-1d試驗(yàn)組高于對(duì)照組（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，活性氧可提高Caspase-3的活性。由圖2B可知，隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組與對(duì)照組Caspase-9活性先降低后升高再降低，0.5-1d 試驗(yàn)組Caspase-9活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。這可能是ROS導(dǎo)致Caspase-3/9活性增大，激活細(xì)胞凋亡酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。宋昱慶等[18]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的活性氧能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的表達(dá)。本試驗(yàn)與上述試驗(yàn)結(jié)果都能夠說(shuō)明細(xì)胞凋亡酶系受到ROS的調(diào)控作用，并且ROS增加了Caspase-3/9的活性。

2.3 ROS對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中MFI的影響

圖3 ROS對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中 MFI的影響（A、B代表在同一時(shí)間點(diǎn)兩組之間差異顯著）Figure 3 Effect of ROS on MFI of yak during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

MFI（肌原纖維蛋白小片化指數(shù)）表征肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞的情況，可以反映肉的嫩化程度，MFI越大，表明肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)受破壞的程度越大，肉的嫩度也越好。圖3中0-8d 試驗(yàn)組與對(duì)照組的MFI均呈現(xiàn)呈上升的趨勢(shì)，但0.5-8d 試驗(yàn)組MFI顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），可能是用H2O2處理后，ROS加強(qiáng)了肌原纖維蛋白的氧化作用，肌原纖維上連接Z線與I 帶、A帶的蛋白降解，導(dǎo)致Z線弱化，肌原纖維降解為數(shù)個(gè)肌節(jié)組成的串聯(lián)體或片斷[19]，表現(xiàn)為MFI上升，最終導(dǎo)致肉被嫰化。

2.4 ROS對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白溶解性的影響

圖4 ROS對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維溶解性的影響（A、B代表在同一時(shí)間點(diǎn)兩組之間差異顯著）Figure 4 Effect of ROS on the solubility of myofibrillar protein of yak during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

肌原纖維蛋白是構(gòu)成肌原纖維的蛋白質(zhì)，也稱不溶性蛋白質(zhì)，占肌肉中總蛋白的40-60%，主要包括肌球蛋白，肌動(dòng)蛋白，肌動(dòng)球蛋白，原肌球蛋白和肌鈣蛋白等。由圖4可知隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)，試驗(yàn)組與對(duì)照組均呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，且試驗(yàn)組均高于對(duì)照組（P＜0.05）。這可能由于 ROS加速蛋白質(zhì)氧化的進(jìn)程，使蛋白質(zhì)理化性質(zhì)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)溶解性增加。

2.5 ROS對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖5 ROS對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中Caspase-3/9活性的影響（A、B代表在同一時(shí)間點(diǎn)兩組之間差異顯著）Figure 5 Effect of ROS on protein secondary structure of yak during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角與無(wú)規(guī)則卷曲。通過(guò)改變蛋白質(zhì)所處環(huán)境，其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變從而導(dǎo)致功能的變化，其中凝膠性的改變包含了肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)與功能的變化[20]。由圖5可見(jiàn)試驗(yàn)組β-折疊在3d、5d、8d時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），無(wú)規(guī)則卷曲在1-8d時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），α-螺旋在0-8d時(shí)逐漸降低。本實(shí)驗(yàn)中二級(jí)結(jié)構(gòu)最明顯的變化是無(wú)規(guī)則卷曲的增加與β-轉(zhuǎn)角的減少，F(xiàn)ang等[21]研究中發(fā)現(xiàn)α-螺旋并不是直接轉(zhuǎn)化為β-折疊，中間需要α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則卷曲的過(guò)程。張玉林等[9]也發(fā)現(xiàn)H2O2可促進(jìn)蛋白氧化，從而促進(jìn)止α-螺旋轉(zhuǎn)化為無(wú)規(guī)卷曲和β-折疊，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.結(jié)論

在牦牛肉宰后成熟過(guò)程中，H2O2促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致MFI升高、肌原纖維溶解性增加，Caspase-3和Caspase-9活性增強(qiáng)，說(shuō)明ROS促進(jìn)了細(xì)胞凋亡和肌原纖維蛋白的降解。同時(shí)，ROS 還影響脂肪族 C-H 基團(tuán)的微環(huán)境，使肌原纖維蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲升高，β-轉(zhuǎn)角降低以及β-折疊的變化從而改變肌原纖維蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。總之，低濃度的H2O2促進(jìn)ROS產(chǎn)生，進(jìn)而增加細(xì)胞凋亡酶活性和促進(jìn)肌原纖維蛋白的降解，使肉的嫩度增加。