陳靖雯 郭道遠(yuǎn) 趙 冰 曹小娟 高 堅(jiān) ,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 2. 武漢百科金典生物科技有限公司;3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 武漢 430070)

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)是我國重要的小型淡水經(jīng)濟(jì)魚類。由于其肉質(zhì)鮮滑, 營養(yǎng)豐富,具有較高的藥用價(jià)值, 素有“水中人參”的稱號, 深受消費(fèi)者喜愛。近幾年, 泥鰍養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷發(fā)展,高密度集約化養(yǎng)殖程度不斷擴(kuò)大, 養(yǎng)殖單位產(chǎn)量逐年提升。然而水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境的惡化, 各種應(yīng)激脅迫因子增加, 魚體質(zhì)變?nèi)趺庖吡ο陆? 養(yǎng)殖過程中魚病頻發(fā)[1]。雖然抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治中有較好的應(yīng)用效果, 但是抗生素對人和動(dòng)物所產(chǎn)生的一系列負(fù)面影響也頻繁發(fā)生[2]。隨著人們生活水平的日益提高, 對水產(chǎn)品的質(zhì)量安全意識不斷增強(qiáng), 尋求其他安全有效的途徑來提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展顯得刻不容緩。

近年來, 益生菌作為飼料添加劑可提高魚類免疫, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到廣泛的關(guān)注[3]。然而在飼料中活益生菌的添加可能會被引進(jìn)到開放的水環(huán)境,引發(fā)人們對水產(chǎn)業(yè)新的擔(dān)憂。滅活菌不會影響其他水生生物生存環(huán)境, 因此被逐漸應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中替代活菌制劑[4]。乳酸菌不耐受高溫高壓環(huán)境, 但是熱滅活乳酸菌(HK-LP)能夠抵抗飼料制粒過程中的高溫高壓[5]。在過去的研究中發(fā)現(xiàn), 加熱滅活的酪酸菌在鮸魚(Miichthys miiuy)身上有明顯的免疫調(diào)節(jié)性能[6]。加熱滅活的創(chuàng)傷弧菌疫苗比福爾馬林滅活的疫苗能更有效地引起牙鲆(Paralichthys olivaceus)的免疫應(yīng)答[7]。滅活乳酸桿菌P-8對大菱鲆(Scophthatmus maximu)幼魚血清生化指標(biāo)和抗氧化能力有顯著性影響[8]。

β-葡聚糖屬于非淀粉多糖, 存在于酵母細(xì)胞壁和真菌的菌絲體中, 是一種具有增強(qiáng)免疫力的多糖[9]。酵母來源的β-葡聚糖因其免疫促進(jìn)作用而被廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物飼料中。在魚類中, β-葡聚糖不僅能夠刺激巨噬細(xì)胞, 提高其殺滅病原菌的能力, 還可以提高魚類非特異性免疫機(jī)制的其他因子,如溶菌酶和補(bǔ)體系統(tǒng)[10]。目前有研究表明, 在飼料中添加β-葡聚糖可以提高凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的增重率并有效地降低了飼料系數(shù)[11], 促進(jìn)錦鯉(Cyprinus carpio)的生長性能[12], 提高南亞野鯪(Labeo rohita)的特定生長率[13], 提高海參(Apostihopus japonicus)抗?fàn)N爛弧菌(Vibrio splendidus)的能力[14]以及提高花鱸(Lateolabrax japonicus)增重率、免疫性能和抗氨氮應(yīng)激能力[15]。

同時(shí), 有研究表明BG和HK-LP具有一定的相互作用, Dawood等[16]發(fā)現(xiàn)BG和HK-LP的相互作用顯著影響了真鯛(Pagrus major)幼魚的表觀消化率及血液中相關(guān)的生理生化指標(biāo)。關(guān)于飼料添加BG和HK-LP對泥鰍生長、免疫性能影響的研究還鮮有報(bào)道。因此, 本研究以泥鰍為實(shí)驗(yàn)對象, 在飼料中添加不同水平BG和HK-LP, 研究對泥鰍幼魚生長性能、腸道脂肪酸組成, 免疫相關(guān)酶活性和基因表達(dá)的影響, 確定BG和HK-LP在泥鰍飼料中的最佳添加量, 為泥鰍專用飼料研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)飼料配制

泥鰍飼料配方設(shè)計(jì)參照Gao等[17]。以脫脂魚粉、大豆?jié)饪s蛋白及酪蛋白為主要蛋白源; 阿爾法淀粉為糖源, 魚油、大豆油和大豆卵磷脂為脂肪源。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為雙因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì), 即在基礎(chǔ)飼料中分別添加0和0.1% β-葡聚糖, 在此基礎(chǔ)上再分別添加0.025%、0.05%和0.1%的滅活乳酸桿菌, 熱滅活植物乳酸桿菌購于Bioforte Biotechnology Corp (中國深圳)。微粒子飼料(0.1—0.3 mm)的制作方法參照Gao等[18]。制作后的飼料放入密封袋中, 于-20℃冰箱中保存待用。飼料營養(yǎng)成分見表 1。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚及投喂實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用泥鰍幼魚在本實(shí)驗(yàn)室繁殖獲得, 具體方法參照Gao等[18]。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)魚房的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。在開始正式實(shí)驗(yàn)前, 泥鰍幼魚暫養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)開始時(shí), 實(shí)驗(yàn)魚饑餓24h, 然后稱取魚體質(zhì)量(平均初始體質(zhì)量約為0.17 g),并挑選出規(guī)格一致的泥鰍進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn), 在18個(gè)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行, 養(yǎng)殖箱體積為50 L (80 cm×40 cm×50 cm), 水體積為40 L, 放養(yǎng)密度為50尾/箱,水流為1 L/min, 每種飼料隨機(jī)投喂3組實(shí)驗(yàn)魚。每天飽食投喂3次(09:00、13:00和20:00)。養(yǎng)殖周期80d。每天記錄投飼量, 如有死魚記錄數(shù)量并稱重。實(shí)驗(yàn)期間水體溫度在26—28℃, 溶氧保持＞5 mg/L。

1.3 樣品采集

在80d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 禁食24h, 對每個(gè)水箱的魚進(jìn)行稱重和計(jì)數(shù), 用于計(jì)算增重率、特定生長率、存活率等指標(biāo)。從每個(gè)水箱中隨機(jī)抽取10尾魚取體表黏液用于免疫活性檢測[19]; 另取10尾魚解剖取腸道, 用于脂肪酸組成分析; 再另取10尾魚解剖取內(nèi)臟, 用作免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的測定。免疫活性檢測的黏液樣品采集后立即開始, 用于腸道脂肪酸組成分析及基因表達(dá)分析樣品分別混合后凍存于-80℃。

1.4 營養(yǎng)組成分析

實(shí)驗(yàn)飼料的常規(guī)營養(yǎng)分析參照AOAC[20]的方法進(jìn)行: 水分含量測定采用105℃烘干法, 粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法, 粗灰分含量測定用馬福爐550℃灼燒法。實(shí)驗(yàn)飼料和全魚體的全脂肪含量分析參照Bligh和Dyer[21]的方法進(jìn)行。

1.5 腸道脂肪酸組成分析

從實(shí)驗(yàn)魚腸道提取的總脂肪經(jīng)過皂化后, 采用氣相色譜(Agilent Technologies Inc., Santa Clara,California, USA; column: OmegawaxTM320)對樣品脂肪酸組成進(jìn)行分析, 方法參照Li等[22]所述。

1.6 免疫相關(guān)酶活性檢測

按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒所示要求和操作, 進(jìn)行體表黏液中蛋白濃度的測定并采用酶促反應(yīng)速度的方法檢測溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)及堿性磷酸酶(AKP)的活性。

1.7 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測免疫相關(guān)基因表達(dá)

提取各實(shí)驗(yàn)組泥鰍肝臟中RNA以液氮為介質(zhì),在研缽中將組織研磨成粉末狀, 按照RNAiso Plus說明書提取并純化總RNA。瓊脂糖凝膠電泳法檢測其完整性, 超微量分光光度計(jì)法檢測其濃度和純度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, China)說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量檢測利用Mini Option實(shí)時(shí)定量PCR檢測系統(tǒng) ( Bio-Rad, USA) 進(jìn)行, 反應(yīng)體系為10 μL∶0.4 μL 10 mmol /μL的上下游引物、1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、5 μL 2 ×SYBR Premix ExTaqTMⅡ S、3.2 μL滅菌水。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)?zāi)圉q轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得泥鰍Hsp70、Hsp90α和Tlr1基因序列, 用Primer premier 5 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR特異引物(表 2)。反應(yīng)條件為 95℃, 10s; 95℃, 15s; 60℃, 15s; 40個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到的Ct值(熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)), 計(jì)算出目標(biāo)基因和對照基因βactin和Gapdh Ct值的差異ΔCt; 以差異最大的樣本作為參照樣本, 計(jì)算出不同樣品相對于參照樣本的基因表達(dá)倍數(shù)2-ΔΔCt, 從而制作出相對定量的圖表。

表 1 實(shí)驗(yàn)用飼料配方及營養(yǎng)組成Tab. 1 Formulation and proximate composition of the experimental diets (%)

表 2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物Tab. 2 Nucleotide sequences of the primers for reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

1.8 相關(guān)指標(biāo)計(jì)算公式

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理, 所有實(shí)驗(yàn)組(2因素3水平, 2×3)進(jìn)行雙因素方差分析(Twoway ANOVA)的基礎(chǔ)上, One-way ANOVA方差分析和Duncan' s均值多重比較法對試驗(yàn)結(jié)果差異顯著性進(jìn)行分析處理。P＜0.05, 認(rèn)為差異顯著 。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 生長性能

通過雙因素方差分析, 飼料添加BG或HKLP分別顯著調(diào)高了泥鰍幼魚的最終均重, 增重率和特定生長率, 顯著減低了飼料系數(shù)(P＜0.05), 但是BG和HK-LP的相互作用對各實(shí)驗(yàn)組泥鰍幼魚的終末體重、增重率、特定成長率和存活率皆無顯著性差異(表 3)。與BG0/HK-LP0.025組相比較,BG1/HK-LP0.1組的最終均重、增重率、特定生長率和飼料系數(shù)出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)。在BG同等添加情況下, HK-LP的添加量為0.1%時(shí)與添加量為0.025%和0.05%的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在最終均重、增重率及特定生長率表現(xiàn)出顯著上升(P＜0.05), 而在飼料系數(shù)顯示為無顯著差異。

2.2 泥鰍幼魚腸道脂肪酸組成分析

泥鰍腸道脂肪酸組成見表 4。結(jié)果顯示飼料中添加BG和HK-LP兩者之間的相互作用對泥鰍腸道內(nèi)的脂肪酸組成無顯著性影響。但是添加1.0%BG飼料顯著降低了泥鰍腸道C16∶1n-7、C18∶2n-6以及總n-6系脂肪酸的比率。隨著HK-LP添加量的升高顯著降低了C22∶ 1n-11的比率(P＜0.05)。

2.3 泥鰍幼魚皮膚黏液中免疫相關(guān)酶表達(dá)情況分析

各組實(shí)驗(yàn)?zāi)圉q幼魚皮膚黏液中LZM、ACP、AKP三種免疫相關(guān)酶進(jìn)行酶活性結(jié)果見圖 1。BG、HK-LP及兩因素的相互作用顯著影響了體表黏液中AKP活性(P＜0.05), 隨著HK-LP的添加濃度增加, AKP活性顯著增強(qiáng)。然而添加1%BG與不添加組相比, AKP活性出現(xiàn)顯著降低趨勢。而HKLP顯著影響了LZM活性(P＜0.05), 且LZM的活性隨HK-LP的濃度上升而增強(qiáng)。

2.4 泥鰍幼魚肝臟中免疫相關(guān)基因表達(dá)變化

添加BG及HK-LP顯著影響了泥鰍肝臟免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平(圖 2)。當(dāng)飼料中添加1%BG和0.05%HK-LP顯著上調(diào)了Hsp70及Hsp90α表達(dá)水平。雙因素方差分析表明: BG的添加顯著降低了Tlr1基因表達(dá)水平(P＜0.05)。

3 討論

在本研究中, 經(jīng)過80d飼喂后, 飼料中添加了BG和HK-LP顯著降低了飼料系數(shù), 提高了泥鰍幼魚的增重率、特定成長率及最終均重。這表明2種添加物質(zhì)均能夠有效地改善泥鰍幼魚的生長性能。同樣結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在其他魚種, 陳超然等[23]在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的研究中發(fā)現(xiàn), 飼料中添加一定量的BG提高了其增重率。在遲淑艷等[24]的研究中也發(fā)現(xiàn), 在奧尼羅非魚(Oreochromis aureus ♂ × O. niloticus♀)中添加1.0%—1.5%的BG能夠顯著改善其生長性能以及抗嗜水氣單胞菌侵染的免疫能力。HK-LP常作為飼料添加劑, 通過定殖于生物體胃腸道等部位后大量繁殖, 可抑制病原菌的生長, 產(chǎn)生維生素和促進(jìn)生長因子等物質(zhì),增加機(jī)體對飼料的消化和吸收, 提高生長與成活[25]。斜帶石斑魚(Epinephelus coiodes)攝食添加一定量的植物乳酸桿菌的飼料4周后, 增重率顯著高于對照組[26]。

表 3 喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)飼料80d后對各實(shí)驗(yàn)組泥鰍幼魚生長性能的影響Tab. 3 Growth performance of juvenile loach fed with test diets for 80 days*

表 4 飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)80d后泥鰍幼魚腸道脂肪酸組成Tab. 4 Fatty acid composition (% of total fatty acids) in intestine of loach after 80 days

圖 1 泥鰍體表黏液中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及血清溶菌的活性(U/mg prot), 數(shù)據(jù)為取樣測得的平均值Fig. 1 The activities of alkaline phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP), lysozyme (LZM) (U/mg protein) in skin mucus of loach

圖 2 肝臟中Hsp70, Tlr1和Hsp90α的表達(dá)情況Fig. 2 Relative mRNA expression levels of Hsp70, Tlr1 and Hsp90α gene in liver of loach

在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn), 飼料中添加適量BG改變了泥鰍腸道微生物菌群, 進(jìn)而降低了泥鰍脂肪的沉積[27], 表明腸道菌群與魚體脂肪吸收和代謝密切相關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn), 飼料中添加BG顯著減低了泥鰍腸道C16∶1n-7及C18∶2n-6的比率, 這可能是因?yàn)樘砑覤G改變了腸道微生物菌群, 而影響了腸道對飼料脂肪酸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn), 從而影響了腸道脂肪酸組成。

BG是一種不能被動(dòng)物腸道自然消化的碳水化合物, 通常與益生菌一起使用, 通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)和刺激免疫系統(tǒng)來促進(jìn)生物長期健康生長。在Dawood等[16]對真鯛的研究中則發(fā)現(xiàn), 飼料中添加HK-LP和BG的相互作用影響了真鯛非特異性免疫活性。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了, 在不添加BG組隨著HK-LP添加量的增加, ACP呈現(xiàn)下降趨勢, 而在BG添加組隨著HK-LP添加量的增加, ACP呈現(xiàn)出升高的趨勢。這表明了飼料BG可影響HK-LP對泥鰍體表黏液中的ACP活性。LZM廣泛存在于魚類各種體液、血清和巨噬細(xì)胞中的一種水解酶, 是生物機(jī)體在免疫反應(yīng)過程中分泌的具有溶解細(xì)菌作用的非特異性免疫因子。LZM活性是決定吞噬細(xì)胞能否殺滅所吞噬的致病菌的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[28]。在本研究中, 隨著BG和HK-LP添加量的增加,LZM活性出現(xiàn)上升, 且1%BG和0.1%HK-LP組顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組, 表明了飼料添加1%BG和0.1%HKLP對泥鰍非特異性免疫具有良好的添加效果。

熱應(yīng)激蛋白(Heat shock protein, HSP)是細(xì)胞在應(yīng)激刺激下生成的一組蛋白質(zhì), 對脅迫環(huán)境的應(yīng)答等起到了重要作用[29]。Hsp70和Hsp90α是HSP家族的重要成員,Hsp70對于應(yīng)激條件可產(chǎn)生耐受和保護(hù)作用, 具有高度保守和交叉耐受性[30], 而Hsp90α通過和抗原的結(jié)合, 參與免疫反應(yīng), 向免疫細(xì)胞提呈抗原肽[31]。在本研究中, 以β-actin和Gapdh作為雙內(nèi)參基因檢測泥鰍肝臟組織中Hsp70,Hsp90α和T l r1的相對表達(dá)量。當(dāng)飼料添加1%B G和0.05%HK-LP時(shí), 泥鰍肝臟Hsp70和Hsp90α表達(dá)水平顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組, 表明了1%BG和0.05%HKLP的添加對泥鰍產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng), 激發(fā)了泥鰍肝臟中熱應(yīng)激蛋白的保護(hù)作用。Toll樣受體(Tlr1)是胚系編碼的模式識別受體, 來識別病原相關(guān)分子模式。在本實(shí)驗(yàn)中, 在無添加BG組, 隨著HK-LP添加量的增加, 上調(diào)了Tlr1表達(dá)水平, 這可能是因?yàn)樘砑親K-LP, 誘發(fā)了泥鰍對病原體的識別系統(tǒng)。而當(dāng)飼料中添加1%BG時(shí), 添加HK-LP沒有對Tlr1產(chǎn)生影響, 關(guān)于BG對Tlr1表達(dá)水平的影響還需進(jìn)一步研究。

綜上所述, 本研究結(jié)果表明, 飼料添加BG和HK-LP可改善泥鰍幼魚的生長及免疫性能, 影響了腸道脂肪酸組成, 激發(fā)了泥鰍Hsp70、Hsp90α及Tlr1基因的表達(dá)水平。因此, 在泥鰍養(yǎng)殖過程中BG和HK-LP可作為有效的飼料免疫增強(qiáng)劑, 在泥鰍幼魚飼料中的最適添加量為: BG 1%和HK-LP 0.1%。