朱雨晴，劉 偉，陳 興，成 策，鄒立強(qiáng)*

（南昌大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的多酚化合物，在食品和化學(xué)工業(yè)中，常作為著色劑、香料和防腐劑，過(guò)去數(shù)千年，南非人也將姜黃素當(dāng)做藥物使用[1-2]。姜黃素具有諸多生理活性，如抗肥胖、抗氧化、抗炎癥、抗病毒和抗癌癥等[3-5]；姜黃素還可以調(diào)控蛋白質(zhì)的聚集程度從而降低蛋白質(zhì)聚集物的毒性[2]；有研究報(bào)道姜黃素可以影響脂質(zhì)代謝，從而減輕高血脂和動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[6]，因此姜黃素近年來(lái)已成為研究熱點(diǎn)。然而，姜黃素的水溶性和熱穩(wěn)定性較差，對(duì)光和pH值敏感，在生理環(huán)境下不穩(wěn)定，生物可利用率低，限制了其在食品和制藥工業(yè)中的應(yīng)用[7]。隨著包埋技術(shù)的發(fā)展，水凝膠、膠束、復(fù)合物納米粒子、乳液和脂質(zhì)體等被用來(lái)包埋姜黃素[8]，旨在提高其生物利用率和擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

脂質(zhì)體是一種自組裝的球形囊泡，包含磷脂雙分子層和疏水性空腔，具有無(wú)毒、生物可降解以及無(wú)過(guò)敏性等特點(diǎn)，可以用于包埋和運(yùn)載多種藥物、營(yíng)養(yǎng)素、功能性因子，從而提高這些生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性和生物可利用率[9-12]。然而，脂質(zhì)體也存在較多缺陷[13-14]。首先，在加工和貯藏過(guò)程中容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致藥物泄漏；其次，磷脂穩(wěn)定性較差，使得脂質(zhì)體在體內(nèi)的生物半衰期較短；再者，脂質(zhì)體表面缺乏與細(xì)胞表面受體蛋白結(jié)合的官能團(tuán)，靶向性差。為彌補(bǔ)傳統(tǒng)脂質(zhì)體的這些缺陷，修飾劑可通過(guò)形成生物黏附和聚合層對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾，改善脂質(zhì)體的性質(zhì)[15]、殼聚糖[16-17]、聚合物電解質(zhì)[18]、蛋白質(zhì)[19]、聚乙二醇[20]等都是常見(jiàn)的修飾劑。

殼聚糖是迄今自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一帶正電的多糖，化學(xué)名為（1→4）-2-氨基-2脫氧-β-D-葡聚糖。由葡萄糖胺共聚物和N-乙酰葡萄糖胺通過(guò)β-（1-4）糖苷鍵組成，大多存在于微生物中，殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性和黏附性[11,21]。有研究表明，殼聚糖包裹可以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和適用性[16,22-23]。葉酸，即蝶酰谷氨酸，是人體必需的B族維生素，且葉酸受體在多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，葉酸修飾可賦予細(xì)胞一定的靶向性。在N-羥基琥珀酰亞胺和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳乙二胺鹽酸鹽的催化作用下，殼聚糖分子的氨基可以和葉酸發(fā)生?；磻?yīng)產(chǎn)生葉酸-殼聚糖復(fù)合物（folic acidchitosan，F(xiàn)A-CS），其反應(yīng)原理如圖1所示[24]。殼聚糖分子帶大量正電荷，F(xiàn)A-CS可通過(guò)靜電相互作用吸附在帶負(fù)電的納米脂質(zhì)體表面形成一種新的運(yùn)載體系，即葉酸-殼聚糖修飾納米脂質(zhì)體（folic acid-chitosan-nanoliposomes，F(xiàn)A-CS-NLs）。

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)采用薄膜分散法結(jié)合動(dòng)態(tài)高壓微射流法成功制備姜黃素納米脂質(zhì)體（nanoliposomescurcumin，NLs-Cur），并發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體具有較好緩釋性、pH值和金屬離子穩(wěn)定性，但是存在細(xì)胞攝取量低的問(wèn)題[25]。為進(jìn)一步提高細(xì)胞攝取量，本實(shí)驗(yàn)以葉酸和殼聚糖為原料合成FA-CS，用于脂質(zhì)體的修飾，得到FA-CS-NLs運(yùn)載體系，用于運(yùn)載姜黃素，并對(duì)其貯存穩(wěn)定性、緩釋性能、細(xì)胞毒性及細(xì)胞攝取量進(jìn)行考察。

圖1 FA-CS合成原理圖Fig. 1 Synthetic route of FA-CS complex

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（mw50 000 Da，脫乙酰度90%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；葉酸（D1525009）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳乙二胺鹽酸鹽（D1525009）、N-羥基琥珀酰亞胺（C1427075）、姜黃素（純度98%） 阿拉丁試劑上海有限公司；大豆磷脂（phospholipid S75） 德國(guó)Lipoid GmbH公司；胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基 北京索萊寶科技公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M-110動(dòng)態(tài)高壓微射流 美國(guó)Microfluidic公司；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Nicomp 380ZLS激光納米粒度儀 美國(guó)Santa Barbara公司；5500原子力顯微鏡 美國(guó)安捷倫科技有限公司；3110 CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Fisher科技公司；IX51-A12PH倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；EPOCHh2酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 FA-CS的合成及葉酸偶聯(lián)率的測(cè)定

FA-CS的合成：參考Yang Kuikun等[24]的方法，以1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳乙二胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺為催化劑，反應(yīng)物中葉酸與殼聚糖的最終物質(zhì)的量（mol）比分別為0.02、0.06和0.12。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物pH值調(diào)至9.0，并轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量為10 kDa的透析袋中透析4 d，每4 h換一次水。透析結(jié)束后，將混合物凍干，得到黃色海綿狀葉酸殼聚糖復(fù)合物。FA-CS的制備過(guò)程均在避光的環(huán)境下進(jìn)行。

葉酸偶聯(lián)率的測(cè)定：將適量的FA-CS凍干物溶解于醋酸-醋酸鈉緩沖液中，用醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后，采用紫外分光光度計(jì)于363 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=0.015x＋0.001 5，R2=0.999 8）計(jì)算葉酸含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍為5～30 μg/mL。根據(jù)公式（1）計(jì)算葉酸偶聯(lián)率：

1.3.2 NLs-Cur、葉酸-殼聚糖修飾姜黃素納米脂質(zhì)體（folic acid-chitosan-nanoliposomes-curcumin，F(xiàn)A-CSNLs-Cur）的制備

NLs-Cur的制備：在實(shí)驗(yàn)室之前的研究方法[25]上稍作修改，采用薄膜分散法結(jié)合動(dòng)態(tài)高壓微射流法制備姜黃素脂質(zhì)體。將姜黃素、大豆磷脂、膽固醇和吐溫-80以1∶28∶4.4∶8的質(zhì)量比溶于無(wú)水乙醇后，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，在45 ℃水浴中進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去乙醇，將pH 6.5的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）緩慢倒入圓底燒瓶中，45 ℃洗膜后得姜黃素粗脂質(zhì)體。粗脂質(zhì)體用微射流在120 MPa的壓力下處理2 個(gè)循環(huán)，制備出NLs-Cur。

FA-CS-NLs-Cur的制備：將FA-CS溶于1%的醋酸溶液中，調(diào)pH值至5.5，制得5g/L的FA-CS溶液。將NLs-Cur逐滴加入到葉酸殼聚糖溶液中，于100 r/min持續(xù)攪拌反應(yīng)2 h，即得FA-CS-NLs-Cur，F(xiàn)A-CS與磷脂的質(zhì)量比為1∶16.8。

1.3.3 原子力顯微鏡觀察FA-CS-NLs-Cur的微觀形貌

原子力顯微鏡的分辨率可達(dá)0.1 nm，與其他電子顯微鏡相比，制樣快速簡(jiǎn)單，可以使得被測(cè)樣品保持原來(lái)的狀態(tài)。參考實(shí)驗(yàn)室之前的研究方法[26]，將脂質(zhì)體稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，先將云母片平穩(wěn)地固定在培養(yǎng)皿內(nèi)，移取1滴脂質(zhì)體滴于干凈的云母片中央，待液滴自然攤開(kāi)風(fēng)干后，將其轉(zhuǎn)移至原子力顯微鏡下采用輕敲模式進(jìn)行觀察。

1.3.4 FA-CS-NLs-Cur的貯存穩(wěn)定性

將NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur貯存在25 ℃恒溫箱中，每隔7 d分別測(cè)定粒徑、電位、分散系數(shù)和姜黃素總量的變化，連續(xù)觀測(cè)28 d。所有的樣品均用超純水稀釋10 倍后，參考實(shí)驗(yàn)室之前的研究方法[26]，采用激光納米粒度儀分別測(cè)定25 ℃樣品的粒徑、電位、分散系數(shù)，光檢測(cè)角度為90°。貯存過(guò)程中姜黃素總量用紫外分光光度法測(cè)定，取樣品100 μL用無(wú)水乙醇稀釋100 倍，于421 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，根據(jù)姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算姜黃素的量。姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.130 4x＋0.002，R2=0.999 5，線(xiàn)性范圍為0.25～10 μg/mL。

1.3.5 FA-CS-NLs-Cur的體外釋放

參考實(shí)驗(yàn)室之前的研究方法[25]對(duì)FA-CS-NLs-Cur的釋放性能進(jìn)行評(píng)估。分別取4 mL NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur于截留分子質(zhì)量為10～12 kDa的透析袋中，分別至于100 mL含0.5%吐溫、20%乙醇的PBS（pH 5.5/pH 7.4）混合液中，37 ℃透析24 h。分別于1、2、4、6、8、10、12、24 h取透析液于421 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算姜黃素的含量。

1.3.6 FA-CS-NLs-Cur的細(xì)胞毒性與細(xì)胞攝取

細(xì)胞毒性的測(cè)定：采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）比色法評(píng)估各組藥物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性[25]。取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白消化酶消化后，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并用新鮮培養(yǎng)基稀釋至2×104cells/mL，以每孔100 μL的接種量將細(xì)胞液接種于96 孔板上。接種完成后將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的空白脂質(zhì)體（空白 NLs和空白 FA-CS-NLs）和姜黃素脂質(zhì)體（NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur），空白對(duì)照組不加藥。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，并用PBS清洗2 次，每孔加入50 μg MTT。繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸去MTT，每孔加入二甲基亞砜150 μL，于搖床上振蕩10 min，使藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)得各孔的吸光度。根據(jù)公式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率：

式中：AT和A0分別為實(shí)驗(yàn)組吸光度和空白組吸光度。

細(xì)胞攝取的測(cè)定[25]：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞，按每孔1×105cells/mL的濃度接種于12 孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)24 h。分別加入20 μg/mL的NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育6 h，取出12 孔板，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2 次，利用姜黃素自發(fā)熒光的特性，于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度并拍照，考察細(xì)胞攝取情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)至少3 組平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 ±s表示，應(yīng)用SPSS 1.7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉酸偶聯(lián)率、葉酸與殼聚糖的確定

分別采用物質(zhì)的量比為0.02、0.06和0.12的FA與CS制備FA-CS，得到的復(fù)合物中葉酸偶聯(lián)率分別為3.4%、7.8%和8.3%，隨著FA與CS物質(zhì)的量比的增加，葉酸偶聯(lián)率增加。但FA與CS物質(zhì)的量比從0.06增加至0.12時(shí)，葉酸偶聯(lián)率的增加并不顯著。Yang等[27]的研究表明，隨著葉酸與氨基的物質(zhì)的量比增加，葉酸與復(fù)合物中葉酸與氨基的物質(zhì)的量比增加，但是復(fù)合物得率下降。此外，F(xiàn)A與CS物質(zhì)的量比為0.12時(shí)，形成的復(fù)合物的復(fù)水性較差，而FA與CS物質(zhì)的量比為0.06時(shí)，合成得到的FA-CS具有較好的復(fù)水性。如圖2a所示，凍干后的FA-CS呈淡黃色雪花狀，溶于pH 4.7的醋酸緩沖液中，可得到透明的淺黃色溶液（圖2b），這表明合成得到的FA-CS具有較好的復(fù)水性。因此，實(shí)驗(yàn)選擇物質(zhì)的量比為0.06的FA與CS制備FA-CS。

圖2 凍干后（a）與復(fù)溶后（b）的FA-CSFig. 2 Freeze-dried (a) and redissolved (b) FA-CS complex

2.2 FA-CS-NLs-Cur的粒徑與微觀形貌

本實(shí)驗(yàn)前期實(shí)驗(yàn)測(cè)得的姜黃素脂質(zhì)體包封率為（57.1±1.1）%[25]。FA-CS-NLs-Cur的微觀形貌采用原子力顯微鏡觀察，如圖3所示。從圖3a、b可以看出，NLs-Cur粒徑小于100 nm，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur粒徑大于100 nm，且粒徑分布均勻，與激光納米粒度儀測(cè)定的結(jié)果一致，NLs-Cur的平均粒徑為（67.4±2.3）nm，分散系數(shù)為0.406±0.016，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur平均粒徑為（103.6±4.1）nm，分散系數(shù)為0.378±0.01（圖3c）。此外，NLs-Cur的表面電位為（－13.81±2.75）mV，而FA-CS-NLs-Cur的表面電位為（16.35±3.54）mV，這說(shuō)明經(jīng)FA-CS修飾在脂質(zhì)體表面后，脂質(zhì)體的粒徑增大，且表面負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾?。這是因?yàn)闅ぞ厶菐в写罅康恼姾桑瑲ぞ厶欠肿又械年?yáng)離子氨基（）與脂質(zhì)體中帶負(fù)電荷的磷酸根（）之間發(fā)生靜電相互作用[28]，使得脂質(zhì)體表面電位發(fā)生改變。Liu等[18]采用殼聚糖和海藻酸鈉對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行層層自組裝修飾，經(jīng)殼聚糖修飾后脂質(zhì)體平均粒徑由（89.3±11.8）nm變?yōu)椋?60.3±28.3）nm，電位由（－6.34±0.62）mV變?yōu)椋?.27±0.67）mV。與之相比，本實(shí)驗(yàn)制備的FA-CS-NLs較修飾之前粒徑增幅較小，對(duì)脂質(zhì)體性質(zhì)的影響更小。

圖3 NLs-Cur（a）和FA-CS-NLs-Cur（b）的微觀形貌圖及其粒徑分布圖（c）Fig. 3 AFM micrographs of NLs-Cur (a) and FA-CS-NLs-Cur (b) and particle size distribution of NLs-Cur and FA-CS-NLs-Cur (c)

2.3 FA-CS-NLs-Cur貯存過(guò)程中理化性質(zhì)的變化

表1 NLs-Cur與FA-CS-NLs-Cur貯存穩(wěn)定性Table 1 Storage stabilities of native and modified curcumin nanoliposomes

脂質(zhì)體在25 ℃的貯存穩(wěn)定性采用粒徑、電位、姜黃素質(zhì)量濃度等參數(shù)進(jìn)行表征。如表1所示，NLs-Cur在25 ℃貯存28 d后，其粒徑、電位均無(wú)顯著性變化，但是姜黃素質(zhì)量濃度由（0.523±0.04）mg/mL下降至（0.428±0.03）mg/mL。FA-CS-NLs-Cur在25 ℃貯存28 d后，其粒徑、電位均無(wú)顯著性差異，姜黃素質(zhì)量濃度由（0.529±0.05）mg/mL下降至（0.499±0.03）mg/mL，這表明FA-CS-NLs-Cur較NLs-Cur在25 ℃姜黃素有更好的貯存穩(wěn)定性。Liu等[28]發(fā)現(xiàn)姜黃素脂質(zhì)體在25 ℃貯存40 d，姜黃素質(zhì)量濃度顯著下降，殼聚糖修飾能顯著增加姜黃素脂質(zhì)體在25 ℃的貯存穩(wěn)定性。Zhou Wei等[29]制備的VC脂質(zhì)體在4 ℃穩(wěn)定性較好，在25 ℃貯存21 d，其粒徑、泄藥率和丙二醛值顯著增大，但經(jīng)低酯或高脂果膠修飾后的脂質(zhì)體在25 ℃的貯存穩(wěn)定性明顯改善。這些結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的FA-CS-NLs-Cur可以有效提高姜黃素在運(yùn)載體系中的貯存穩(wěn)定性。

2.4 FA-CS-NLs-Cur的緩釋性能

為模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)部弱酸性環(huán)境和生物體內(nèi)的弱堿性環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)考察24 h內(nèi)NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur在37 ℃、pH 5.5及37 ℃、pH 7.4環(huán)境下藥物釋放情況，用紫外分光光度法測(cè)定釋放過(guò)程中姜黃素的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為：y = 0.130 4x－0.002，R2= 0.999 5。藥物釋放情況如圖4所示，在弱堿性環(huán)境下（pH 7.4），經(jīng)24 h透析時(shí)，NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur姜黃素釋放率分別為22.4%和17.7%；在弱酸性環(huán)境下（pH 5.5），經(jīng)24 h透析時(shí)，NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur姜黃素釋放率分別為25.4%和27.2%。這表明在pH 7.4環(huán)境下，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur的緩釋性能優(yōu)于NLs-Cur；在pH 5.5環(huán)境下，NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur的緩釋能力差異不大。

NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur在pH 7.4和pH 5.5環(huán)境下，10 h內(nèi)姜黃素釋放速度較快，10 h后姜黃素緩慢釋放。這是由于吸附在脂質(zhì)體表面和溶解在膠束里的姜黃素很容易釋放出來(lái)，而包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部的姜黃素難以釋放，前10 h釋放的大多是吸附在脂質(zhì)體表面和溶解在膠束里的姜黃素。

此外，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur在pH 7.4環(huán)境下的緩釋性能顯著優(yōu)于pH 5.5環(huán)境下的緩釋性能，這說(shuō)明FA-CS-NLs-Cur在體循環(huán)pH值環(huán)境中能發(fā)揮較佳的緩釋作用，但當(dāng)FACS-NLs-Cur到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部pH值環(huán)境時(shí)，藥物釋放加快。這可能是由于在不同的pH值環(huán)境中，多聚物呈現(xiàn)出松弛或禁閉的狀態(tài)，影響其與磷脂膜的作用力，從而改變姜黃素的釋放速率。在酸性環(huán)境下，F(xiàn)A-CS通過(guò)質(zhì)子化作用呈現(xiàn)溶解的松弛狀態(tài)，而在堿性環(huán)境下，F(xiàn)A-CS處于曲縮狀態(tài)。它們不同的狀態(tài)也影響到與脂質(zhì)體膜的結(jié)合狀態(tài)，從而影響載藥體系的緩釋特性。Yuan Roufen等[30]制備了甘草次酸修飾的姜黃素支鏈淀粉納米粒子（Cur-GAP NPs），且Cur-GAP NPs在pH 7.4環(huán)境下的緩釋性能優(yōu)于pH 5.8環(huán)境下的緩釋性能。Salem等[31]制備了葉酸修飾的β-環(huán)糊精磁性納米粒子，并用于運(yùn)載姜黃素，發(fā)現(xiàn)姜黃素在pH 5.4的環(huán)境下的釋放速率較pH 7.4更快。這可能是由于弱酸性條件下，姜黃素中烯羧酸電離度下降，導(dǎo)致姜黃素疏水性增強(qiáng)，更傾向于被包埋在β-環(huán)糊精疏水性?xún)?nèi)腔中。

2.5 FA-CS-NLs-Cur的細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取

2.5.1 細(xì)胞毒性

圖5 不同磷脂和姜黃素質(zhì)量濃度下空白NLs和空白FA-CS-NLs（A）以及NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur（B）的細(xì)胞毒性Fig. 5 Cytotoxicity of native and modified nanoliposomes without curcumin at different lipid concentrations (A) and containing curcumin (B) at different lipid concentrations

采用MTT比色法測(cè)定藥物的細(xì)胞毒性，其原理為：活細(xì)胞線(xiàn)粒體中琥珀酸脫氫酶可以還原MTT形成藍(lán)紫色甲瓚沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有此功能[32]。本實(shí)驗(yàn)依次考察NLs-Cur、FA-CS-NLs-Cur及空白脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。如圖5A所示，經(jīng)空白NLs與空白FA-CS-NLs處理后，細(xì)胞的存活率在99%～106%之間，這表明磷脂質(zhì)量濃度為0.56～2.24 mg/mL的空白NLs與空白FA-CS-NLs對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒性。

NLs-Cur與FA-CS-NLs-Cur的細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果如圖5B所示，當(dāng)姜黃素質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，NLs-Cur及FA-CS-NLs-Cur的細(xì)胞存活率分別為84%、78%；當(dāng)姜黃素質(zhì)量濃度為80 μg/mL時(shí)，NLs-Cur處理的細(xì)胞存活率為38%，而FA-CS-NLs-Cur處理的細(xì)胞存活率僅為26%。隨著姜黃素質(zhì)量濃度（20～80 μg/mL）的增加，細(xì)胞存活率顯著降低，且相同姜黃素質(zhì)量濃度下，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur的細(xì)胞存活率明顯低于NLs-Cur。這說(shuō)明姜黃素質(zhì)量濃度為20～80 μg/mL時(shí)，隨著姜黃素質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur與NLs-Cur的細(xì)胞毒性均增大，且相同姜黃素質(zhì)量濃度下前者的細(xì)胞毒性更大。

采用倒置顯微鏡對(duì)空白對(duì)照組（PBS）和實(shí)驗(yàn)組（FA-CS-NLs-Cur與NLs-Cur）細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察，進(jìn)一步驗(yàn)證FA-CS-NLs-Cur與NLs-Cur對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。如圖6所示，空白對(duì)照的細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，細(xì)胞間界限清晰，形態(tài)良好，數(shù)量最多。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，隨著藥物濃度的遞增，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur與NLs-Cur組的細(xì)胞數(shù)量下降，而且細(xì)胞呈現(xiàn)畸形狀態(tài)，細(xì)胞皺縮、失去原有形態(tài)。在相同姜黃素質(zhì)量濃度的情況下，F(xiàn)A-CSNLs-Cur組的細(xì)胞殘片碎片明顯多于NLs-Cur組，該結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。Yuan Roufen等[30]的研究表明，隨姜黃素質(zhì)量濃度的增加，游離姜黃素和甘草次酸修飾的姜黃素支鏈淀粉納米粒子（Cur-GAP NPs）對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性均增加，且相同姜黃素質(zhì)量濃度下，包埋的姜黃素毒性較游離姜黃素更高，這是由于肝細(xì)胞表面大量的甘草次酸受體和支鏈淀粉對(duì)肝臟的吸附作用引起的；Li Lielie等[33]制備的葉酸-聚二乙炔修飾的脂質(zhì)體運(yùn)載體和聚二乙炔修飾的脂質(zhì)體運(yùn)載體對(duì)細(xì)胞存活率幾乎沒(méi)有影響，運(yùn)載多烯紫杉醇后，相同藥物濃度下，葉酸-聚二乙炔修飾的脂質(zhì)體較聚二乙炔修飾的脂質(zhì)體對(duì)乳腺癌細(xì)胞（Bcap-37 cells）毒性更大，然而對(duì)人乳腺細(xì)胞（Hs578Bst cells）毒性相當(dāng)，這是由于癌細(xì)胞表面葉酸受體過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致的。這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，脂質(zhì)體包埋活性物質(zhì)后，細(xì)胞毒性均有一定程度的增加，這可能是活性物質(zhì)與運(yùn)載體系的相互作用引起的。

圖6 脂質(zhì)體處理24 h后結(jié)腸癌細(xì)胞的形態(tài)Fig. 6 Morphology of Caco-2 cells treated with liposomes for 24 h

2.5.2 細(xì)胞攝取

采用倒置熒光顯微鏡觀察經(jīng)FA-CS-NLs-Cur與NLs-Cur處理6 h后，結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)姜黃素的攝取情況。在姜黃素質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，經(jīng)NLs-Cur與FA-CS-NLs-Cur處理后細(xì)胞存活率均大于80%，因此，采用該質(zhì)量濃度進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，利用姜黃素自發(fā)熒光的性質(zhì)觀察姜黃素的攝取情況。如圖7所示，經(jīng)6 h孵育后，F(xiàn)A-CSNLs-Cur處理后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著高于NLs-Cur處理的細(xì)胞，這表明結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)FA-CS-NLs-Cur的攝取量高于NLs-Cur，也導(dǎo)致相同姜黃素質(zhì)量濃度下，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur細(xì)胞毒性更大。由于結(jié)腸癌細(xì)胞表面葉酸受體過(guò)度表達(dá)[34]，在葉酸的介導(dǎo)作用下，脂質(zhì)體更易于進(jìn)入細(xì)胞，從而增加姜黃素的細(xì)胞攝取。Yang Kuikun等[24]采用FACS-NLs包埋熒光素，發(fā)現(xiàn)葉酸修飾后的熒光素脂質(zhì)體細(xì)胞攝取量顯著高于普通脂質(zhì)體包埋的熒光素，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖7 NLs-Cur（a）、FA-CS-NLs-Cur（b）與結(jié)腸癌細(xì)胞作用6 h后的攝取熒光圖Fig. 7 Fluorescent images of Caco-2 cells treated with native and modified nanoliposomes containing curcumin for 6 h

3 結(jié) 論

本研究合成了FA-CS，并用于修飾脂質(zhì)體，構(gòu)建FACS-NLs運(yùn)載體系，該體系運(yùn)載的姜黃素較普通脂質(zhì)體運(yùn)載的姜黃素在25 ℃貯存穩(wěn)定性更好。在pH 7.4環(huán)境下，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur的緩釋性能優(yōu)于NLs-Cur；在pH 5.5環(huán)境下，NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur的緩釋能力差異不大；此外，F(xiàn)A-CS-NLs-Cur在pH 5.5環(huán)境下姜黃素的釋放顯著快于pH 7.4環(huán)境下。在相同姜黃素質(zhì)量濃度下，F(xiàn)A-CSNLs-Cur的細(xì)胞毒性大于NLs-Cur，且經(jīng)葉酸修飾后細(xì)胞對(duì)姜黃素脂質(zhì)體的攝取量有所提高。因此，作為一種無(wú)細(xì)胞毒性的運(yùn)載體系，F(xiàn)A-CS-NLs有潛力開(kāi)發(fā)為一種可通過(guò)改變pH值控制釋放的藥物載體。