李若婉，周長慧，黃鵬程，于春榮，2，常 艷

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100038）

在藥物非臨床安全性評價中，遺傳毒性評估是重要的組成部分之一。目前常用于評價化合物誘導(dǎo)基因突變的試驗方法主要是細菌回復(fù)突變試驗（Ames試驗）、TK基因突變試驗和轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)基因突變試驗。嚙齒類動物磷脂酰肌醇聚糖A 類（phosphatidylinositol glycan class-A，Pig-a）基因突變試驗，是一項新的檢測體內(nèi)基因突變的方法，國際人用藥物注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會議（The International Council for Harmonization，ICH）M7指南中已將其列為藥物雜質(zhì)遺傳毒性試驗陽性結(jié)果的追加試驗。

對于人類PIG-A 基因的早期研究主要是源于陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）。PIG-A基因位于X染色體短臂，缺乏等位基因，是控制糖基磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）錨蛋白合成的基因之一。1993 年，Miyata 等[1]發(fā)現(xiàn)，GPI錨鏈蛋白（GPIanchored protein，GPI-AP）缺陷是由于PIG-A 基因異常引起，當(dāng)PIG-A 基因發(fā)生突變時，細胞將不能正常合成GPI 錨，致使細胞表面GPI-AP缺失〔GPI（-）〕。研究表明，GPI 的生物合成過程在許多低等和高等真核生物中高度保守[2]，當(dāng)人體細胞（如骨髓造血干細胞）或體外培養(yǎng)的人體細胞接觸誘變劑，如基因突變誘變劑或染色體斷裂劑后，可能導(dǎo)致PIG-A 基因發(fā)生基因沉默突變，進而引發(fā)GPI 錨合成障礙[2-3]。經(jīng)過一段時間的細胞表達期后，使用特定的檢測手段，如流式細胞術(shù)檢測GPI-AP（表型）的有無，即可判斷PIG-A 基因（基因型）是否發(fā)生突變[4]。PIG-A（嚙齒類動物Pig-a）基因突變試驗正是基于以上理論基礎(chǔ)建立的一項新的基因突變檢測方法[5]。

利用流式細胞術(shù)檢測GPI 錨蛋白缺失的細胞頻率是檢測PIG-A/Pig-a基因突變最可靠和最敏感的方法。CD59（膜反應(yīng)性溶解抑制物）、CD55（衰變加速因子）和BLAST-1/CD48（B淋巴細胞活化標記物）作為GPI-AP，常被用做GP（I-）的表型標記抗原[6]。由于嚙齒類動物與人的種屬差異性，開發(fā)人外周血以及體外培養(yǎng)人細胞的PIG-A基因突變試驗成為近年來致突變研究的重要方向。本文對使用人血細胞和人細胞系進行PIG-A基因突變試驗的研究進展進行簡要綜述。

1 人血細胞PIG-A基因突變檢測

1.1 成熟紅細胞

Dobrovolsky 等[7]開發(fā)了使用流式細胞術(shù)通過標記紅細胞（red blood cells，RBC）CD59抗原檢測人成熟RBC PIG-A 基因突變試驗的方法。通過調(diào)查97 例健康志愿者和10 例癌癥患者發(fā)現(xiàn)，外周血中CD59 缺陷型RBC（RBCCD59-）的平均突變頻率（mutant frequency，MF）較低，約為5×10-6；女性的MF＞男性。此外，對于接受≥2種遺傳毒性藥物化療的癌癥患者，RBCCD59-的MF并未受到治療的明顯影響，可能的原因是聯(lián)合用藥的細胞毒性較單一化療治療更大，而遺傳毒性反而較單一用藥更低。Cao等[8]通過調(diào)查217 例志愿者得出相似的結(jié)果，RBCCD59-的MF與年齡和吸煙狀況無明顯相關(guān)性，但男性MF＞女性。該結(jié)果與Dobrovolsky等[7]研究結(jié)果相反，原因可能為人群樣本的選擇差異，如吸煙和性別比例等。Horibata 等[9]采用流式細胞術(shù)以CD235ab，CD59 和CD71 抗體標記RBC 的方法，分析了10 例健康志愿者和27 例癌癥患者RBC 的PIG-A MF；其中，27 例癌癥患者接受了16 種不同化療藥物的治療。結(jié)果顯示，健康志愿者和27例癌癥患者RBC的PIG-A基因MF分別為（0.00～5.00）×10-6和（0.00～49.67）×10-6；27例癌癥患者中僅2例患者表現(xiàn)出PIG-A 基因MF 顯著升高，可能為藥物化療導(dǎo)致。因無患者治療前的PIG-A MF 供參考，其PIG-A MF升高也可能與癌癥類型和患者有較高背景MF有關(guān)。

1.2 網(wǎng)織紅細胞

PNH是由于PIG-A基因突變引起的遺傳疾病，在PNH 的臨床診斷中，Dworacki 等[10]使用流式細胞術(shù)檢測了RBC 表面的CD55 和CD59 分子，發(fā)現(xiàn)PNH 患者血細胞中網(wǎng)織紅細胞（reticulocytes，RET）比例增多，由于RET比RBC更能抵抗溶血的影響，因此認為RET 比RBC 更適合用作PNH 診斷的目標細胞。同時，RET 相對于RBC 進入到血液循環(huán)中的時間較短，受到補體的攻擊較少，RET 中PIG-A 突變細胞的比例也高于RBC 中突變細胞的比例[7]。Dertinger等[11]描述了一種通過檢測CD55和CD59 分子表達來檢測人RET 和RBC 中PIG-A MF 的方法。其通過調(diào)查52 例健康志愿者，使用免疫磁珠分離去除野生型細胞而富集PIG-A 突變表型細胞，其中RETCD59-/CD55-和RBCCD59-/CD55-的總體平均MF分別為6.0×10-6和2.9×10-6。PIG-A基因在RET中的MF始終高于其在RBC中的MF，RETCD59-/CD55-頻率可更準確地反映PIG-A的MF。

1.3 白細胞

由于不同造血細胞系中GPI 錨鏈蛋白的表達具有差異，如果僅使用一種單克隆抗體進行標記，易導(dǎo)致PIG-A 基因突變診斷出現(xiàn)假陽性結(jié)果[12]。因此，可使用2 種不同細胞譜系和2 種不同GPI 錨鏈蛋白進行標記檢測，以降低假陽性率，如同時評估RBC 和粒細胞表面CD55 和CD59 分子的表達[13]。RBC 表面GPI 錨鏈蛋白的檢測易受溶血與輸血的影響，粒細胞和單核細胞的檢測則不受影響。因此，Rondelli等[14]通過標記CD55和CD59分子研究外周血粒細胞中PIG-A基因MF。該研究選擇了142 例健康志愿者的外周血，使用雙梯度離心法分離出粒細胞，以CD59，CD55，CD24，CD45 和CD11b 5 種單克隆抗體標記。流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，粒細胞的PIG-A MF 中位數(shù)為4.9×10-6，范圍（1.0～37.5）×10-6，且粒細胞中PIG-A 基因MF 與年齡和性別無顯著的相關(guān)性。

FLAER 試劑是一種嗜水氣單胞菌溶素前體變異體，可以與所有白細胞的GPI 錨蛋白特異性結(jié)合，不會因不同細胞表達GPI-AP 的數(shù)量和種類不同造成差異[15]。因此，用熒光分子偶聯(lián)無活性FLAER 試劑能直接標記細胞表面全部的GPI 錨蛋白，比其他表面抗原能更敏感地檢測出GPI 陰性細胞，進而評價PIG-A基因MF[16]。

Brodsky 等[17]比較了FLAER 標記和CD59 抗體標記的8 例PNH 患者白細胞GPI 錨鏈蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)FLAER 分析法比常規(guī)流式細胞術(shù)檢測PNH更靈敏。Sachdeva等[18]回顧性比較了使用和不使用FLAER試劑標記進行流式細胞術(shù)篩查1004例患者PNH克隆的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)隨著FLAER的引入，使用FLAER/CD55/CD15 抗體、FLAER/CD24/CD15抗體和FLAER/CD14/CD33抗體組合標記外周血細胞、中性粒細胞和單核細胞，PNH 克隆的檢出率由4.5%顯著增加至9.2%。與基于CD55 和CD59 的傳統(tǒng)測定法相比，F(xiàn)LAER 多參數(shù)測定法是一種用于更靈敏檢測再生障礙性貧血患者中PNH克隆的方法。FLAER 檢測法對PNH 的檢出，同樣可以用于PIG-A基因突變的檢測。

上述研究表明，使用人血細胞的PIG-A 檢測方法有可能成為臨床基因突變檢測的方法之一，但需要以大量人群為基礎(chǔ)的研究進行驗證。

2 人細胞系PIG-A基因突變檢測

最近已有報道，在體外人成淋巴TK6 細胞和MCL-5 人淋巴細胞中成功建立了PIG-A 基因突變試驗，用于體外誘變劑的檢測。TK6 細胞是起源于人造血系統(tǒng)的懸浮培養(yǎng)細胞，P53蛋白功能完整，在遺傳毒性試驗中具有高靈敏性和高特異性，可以減少試驗的假陽性結(jié)果[19]。

Krüger等[20]采用B淋巴母細胞TK6細胞，通過對2 種GPI-AP（CD55 和CD59）以及1 種GPI 非依賴性跨膜蛋白CD19（標記淋巴細胞）染色評價了化合物甲基磺酸乙酯、環(huán)己酰亞胺、放線菌酮、吡啶以及紫外線C 的遺傳毒性。結(jié)果顯示，甲基磺酸乙酯、紫外線C和環(huán)己酰亞胺組誘導(dǎo)的GP（I-）頻率較陰性對照組顯著增加，并呈濃度依賴關(guān)系；吡啶和放線菌酮組GPI（-）頻率相對于陰性對照組未增加。上述試驗結(jié)果表明，使用TK6細胞以PIG-A基因為生物標志物進行的體外致突變試驗方法是可行的。同時，他們將以氣單胞菌溶素為選擇劑的有限稀釋克隆法與流式細胞術(shù)檢測PIG-A 突變的方法進行對比，驗證了流式細胞術(shù)在快速定量檢測PIG-A基因突變的適用性。

Rees等[3]建立了基于TK6細胞、MCL-5和AHH-1人成淋巴樣細胞的流式細胞術(shù)檢測PIG-A基因突變的方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TK6細胞本身具有較高GP（I-）頻率，而MCL-5細胞本身具有代謝活性以及較低的背景自發(fā)突變率，可作為TK6 細胞的替代，在體外PIG-A 基因突變試驗中具有更大的優(yōu)勢。另外，Yuan 等[21]利用基因組編輯技術(shù)敲除PIG-A 亞等位基因（PIG-Ac.1234C＞T 突變），建立了人類誘導(dǎo)多能干細胞PIG-A 基因功能缺失的細胞模型，以研究PIG-A基因的亞等位基因?qū)ι窠?jīng)元發(fā)育的影響。該細胞模型亦可用于研究PIG-A 基因家族的突變與錨鏈蛋白表型的關(guān)系。

3 影響試驗準確性的因素

目前已建立檢測人血細胞和人細胞系PIG-A基因突變的試驗策略，但均處于前期開發(fā)階段，存在較多影響因素。

3.1 細胞系的基礎(chǔ)突變率

PIG-A 基因突變試驗系統(tǒng)應(yīng)具有較低背景的MF，以提高檢測誘變劑的靈敏度。采用TK6 細胞或其他高基礎(chǔ)MF的細胞系進行體外PIG-A基因突變檢測時，需要在試驗前清除TK6細胞中預(yù)先存在的GP（I-）細胞。主要方法有流式細胞術(shù)分選、免疫吸附分離和單細胞克隆等，其中流式細胞術(shù)分選主要采用熒光標記基因突變細胞，經(jīng)流式分選并分離去除基因突變細胞；免疫吸附又可分為抗體包被平皿吸附和免疫磁珠吸附?？贵w包被平皿是通過抗CD55 抗體包被平皿后吸附CD55 表達細胞，洗脫后分離去除基因突變細胞；而免疫磁珠則利用具有磁性的抗熒光素微珠標記CD55 抗體連接的熒光素，再經(jīng)過分選柱強磁場吸附連接有磁性微珠的細胞，而未連接磁珠的細胞則順利通過分選柱，以此達到分離的效果。單細胞克隆法是通過無限稀釋法，將單細胞接種在96 孔板中，選取形成的單克隆細胞，擴大培養(yǎng)后檢測基礎(chǔ)MF[3]。

3.2 細胞毒性

細胞毒性的評估與遺傳毒性試驗的劑量選擇和試驗結(jié)果的解釋具有相關(guān)性，包括基因突變試驗。因此，選擇合適的細胞毒性評估參數(shù)，如相對細胞增加率和相對細胞倍增數(shù)，可降低對遺傳毒性試驗結(jié)果的誤判，也可為試驗持續(xù)的時間提供依據(jù)[22]。

3.3 表觀遺傳學(xué)

表觀遺傳學(xué)改變（如次甲基/超甲基化的影響）也可能導(dǎo)致PIG-A基因沉默，但該沉默常常被認為是背景突變中固有的事件。就PIG-A而言，這種表觀遺傳事件（如啟動子超甲基化）的發(fā)生是非常罕見的。對健康志愿者粒細胞中分離的GP（I-）細胞進行DNA測序，總能發(fā)現(xiàn)PIG-A基因的失活突變[14，23]。

3.4 基因型與表型的關(guān)系

Nicklas等[24]結(jié)合有限稀釋克隆法結(jié)合DNA測序研究表明，TK6細胞系中自發(fā)突變導(dǎo)致的GPI-AP缺失主要是由PIG-L 基因突變導(dǎo)致，經(jīng)甲基磺酸乙酯處理后，PIG-A 基因和PIG-L 基因的點突變增加。Krüger 等[25]應(yīng)用新一代測序技術(shù)同樣研究了TK6 細胞中與GPI-AP 相關(guān)的基因型與表型關(guān)系。結(jié)果表明，GPI-AP 表型缺失是由PIG-A基因突變，PIG-A mRNA完全缺乏或PIG-L基因雜合性缺失導(dǎo)致。PIG-A 基因型和表型的關(guān)系驗證仍在進行中，這需要有效且精確的門控策略結(jié)合全基因組測序技術(shù)來判斷表型丟失的原因。

4 結(jié)語

PIG-A基因可作為“哨兵”基因監(jiān)測人體暴露于潛在基因毒素的體細胞突變。目前的研究發(fā)現(xiàn)，人類PIG-A 基因MF 存在較大的個體間差異。因此，針對人類PIG-A基因監(jiān)測需要收集廣泛的人群突變基礎(chǔ)值建立數(shù)據(jù)庫[11]。同時，體外培養(yǎng)細胞PIG-A基因突變檢測方法在評估某些化學(xué)或物理因素潛在致突變性方面具有良好的應(yīng)用前景。但仍需對試驗所用細胞系進行廣泛的表型驗證，擴大驗證化合物庫，對試驗方法的特異性、靈敏度以及實驗室間可轉(zhuǎn)移性進行全面評估，最終建立一個用于遺傳毒性風(fēng)險監(jiān)管和評價的體內(nèi)外高通量基因突變檢測系統(tǒng)。