流感病毒屬于正粘病毒科，根據其核蛋白(nucleoprotein，NP)和基質蛋白(Matrix protein，MP)抗原性的不同，可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四型。其中，A型流感病毒又根據血凝素(Hemaglutinin，HA)與神經氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同，可將其分為18個HA亞型和11個NA亞型[1-3]，不同的HA與NA類型之間可任意組合成不同亞型的流感病毒。A型流感病毒屬分節(jié)段、單股負鏈RNA病毒，病毒基因容易發(fā)生突變和基因重配，進而進化演變成新型流感病毒，其中病毒基因重配過程復雜且不可預測，給流感病毒的監(jiān)控帶來巨大的困難。多年來，禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV) H5N1、H5N6、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8等相繼從禽類跨物種間屏障直接感染人[4-9]。令人擔憂的是，H6病毒在禽類普遍流行甚至直接感染人，并易與其它流感病毒亞型發(fā)生基因重配，形成感染人類的新型禽流感病毒H5N1、H5N6[5-6, 10]，對人類健康造成潛在巨大的威脅。

H6N6亞型AIV因其屬低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)而一直未引起重視。然而，H6亞型禽流感宿主廣泛，在絕大部分野生或家養(yǎng)禽類動物中均可分離到H6亞型流感病毒，并且經常與H5N1、H9N2同時存在于家禽動物體內，這給H6亞型流感病毒的基因重配提供了機會，或者為其他亞型流感病毒基因變異提供基因供體。因此，在流感病毒進化過程中，H6N6亞型AIV有可能是新型重配病毒的先祖。另外，近幾年陸續(xù)有報道指出H6N6亞型AIV可以感染小鼠、雪雕、豬等哺乳動物，甚至在健康人群中檢測到H6亞型AIV的血清特異性抗體[11-13]。以上事實說明了H6N6亞型AIV不僅從禽類跨種間感染哺乳動物的能力，甚至也有可能感染人的潛在危險。

1 H6N6亞型AIV起源和在禽類動物流行情況

1965年，首次從火雞分離到H6流感病毒亞型[14]，此后從野生水禽和家禽陸續(xù)分離到H6病毒，并且在這些宿主分離率逐漸升高[15]。在北美洲連續(xù)監(jiān)測26年顯示野生水禽動物中H6是分離率最高的亞型[16]，歐洲的德國和荷蘭進行長達9至12年的監(jiān)測發(fā)現H6亞型是歐洲水禽動物最常見的亞型[15, 17]，中國南部和東部，H6亞型是3種最常見的亞型[18-20]。2000年，H6亞型病毒在美洲與歐亞之間出現洲際傳播，在瑞典分離到的H6病毒為來自北美病毒譜系的5個基因節(jié)段和來自歐亞病毒譜系的3個基因節(jié)段重配而成[21]，進一步的大規(guī)模分析表明，歐亞H6病毒在20世紀70年代初至2000年代中期曾多次傳入美國[22]，此后，歐亞H6病毒開始在北美洲水禽中流行并逐漸成為那里的主要譜系[23]。目前，H6亞型AIV已廣泛存在于世界各地，其主要分為北美分支和歐亞分支，其中歐亞分支又可分為I組(ST339-like)、II組(ST2853-like)、III組(HN573-like)。在中國活禽市場，H6病毒，包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6、H6N8感染家禽并在其流行好長一段時間[20, 24]。調查顯示，2002-2008年我國的H6亞型流感病毒主要是H6N2亞型，但是自從2009年H6N6亞型出現后，2種病毒并存于活禽市場，進而H6N2亞型逐漸被H6N6取代[20, 25-26]。病毒基因序列分析發(fā)現，該兩種亞型的病毒均屬于歐亞分支，且H6N2亞型AIV與傳統(tǒng)病毒一直有高度同源性，但是H6N6亞型AIV則是一株新的重組病毒，其中的PA片段來源于H5N2或H5N6病毒[27]，同時 2014年在四川首次出現的人感染H5N6亞型AIV病例中，經分析發(fā)現H5N6亞型病毒的NA片段來源于H6N6亞型病毒[28]，故可認為2株病毒之間相互促進對方的重配。

以前研究表明，雞是AIV向人類傳播的潛在中間宿主，并可能產生具有流行潛能的新型流感病毒[29-30]。2014年1月至2015年7月，Wu等[31]在浙江家禽市場中共分離出12株H6N6禽流感病毒，進化分析表明，這些H6N6 AIV的HA基因與2000—2014年東亞流行的II組(ST2853-like)密切相關。 NA基因進化分析表明，浙江省有2個不同的基因型共流行，其中第I組包括A/Ck/ZJ/110102/2015(H6N6)、A/Ck/ZJ/110144/2015(H6N6)和A/Ck /ZJ/74154/2015(H6N6)，這些病毒與H6N6和H5N6病毒密切相關，并且在NA莖區(qū)中缺失11個氨基酸(位點59-69)。這些結果與以前的研究結果一致，即來自家禽的H6N6病毒可以作為先祖，通過基因重配產生新感染人的高致病禽流感病毒H5N6。一些H6N6 AIV是重配病毒，這些重配病毒從中國家禽H6、H9和H10亞型病毒中獲得了基因，此結果也為中國東部H6亞型AIV的活躍演化提供了更多的證據，同時考慮到分離的H6N6病毒是從雞中分離出來的，雞可能在產生新的H6N6 AIV中起重要作用。所有雞源H6N6病毒的HA裂解位點模式均為PQIETR/GL，顯示單個堿性氨基酸切割位點的特征，屬低致病性病毒。HA受體結合位點為Q226和G228，提示這些H6N6傾向與禽型SA-2，3-Gal受體結合。S137N、D19V和G228S突變有利于流感病毒與人型受體的親和性，在H6N6亞型 AIV中沒有觀察到S137N和G228S突變，而在A/Ck/ZJ / 727009/2014(H6N6)、A/ Ck /ZJ / 727023/2014(H6N6)和A/ Ck /ZJ / 727028/2014(H6N6)分離株中觀察到D19V突變，但目前尚不清楚這是否改變流感病毒對受體的親和力。PB2 E627K 能提高多聚酶活性，促進病毒復制，增強病毒對哺乳動物的致病力，但在H6N6 AIV的PB2中未觀察到這些替換。然而，Zou[26]等應用受體結合特異性分析，發(fā)現一些H6N6 AIV已經獲得了識別人型受體的能力，同時通過生長動力學實驗證實，某些H6N6病毒在哺乳動物細胞中復制能力比其它病毒更強并獲得更高的滴度，表明病毒與人型SA-2，6-Gal受體結合增強，與其在哺乳動物細胞中病毒復制增加相關。因此，在家禽流行的H6N6 AIV是否獲得了識別人型SA-2，6-Gal受體的能力，仍需進一步深入研究。

2 H6N6亞型AIV跨種屬感染哺乳動物

H6N6亞型AIV在野生禽類動物和家禽的廣泛流行、進化演變，該病毒有跨種間屏障感染哺乳動物的潛能。動物感染試驗表明，一些H6N6病毒無需適應就可在哺乳動物小鼠有效復制[11, 31]。2011年華南農業(yè)大學首次報道[13]在中國南方分離到豬源H6N6病毒A/SW/GD/ K6 / 2010(GDK6)，基因進化分析表明該病毒來源于家鴨，GDK6病毒的HA屬于H6歐亞分支II組病毒，是華南家鴨中主要流行的H6病毒。該病毒的NA、PB1、PA、NP、NS和MP也來自水禽。PB2基因與H5N1高致病性禽流感病毒具有較近的親緣關系。在同批次樣本中還分離獲得H1N1、H1N2、H3N2、H9N2等亞型病毒，表明了H6N6具有在自然條件下感染豬的能力以及豬可以同時感染不同的流感病毒亞型，不同亞型病毒在豬體內有可能重配成新亞型病毒并跨種間屏障傳播到人類的風險。血清學調查發(fā)現中國南方豬血清H6抗體陽性率為3.4%[13]。隨后，從中國東部的豬中也分離出另一株H6N6病毒[32]。Tan等[11]用GDK6病毒在小鼠肺組織反復傳代獲取小鼠適應型豬流感病毒A/SW/GD/ K6 /2010(H6N6)[GDK6-MA]，該變異病毒顯示出比野生型病毒(GDK6)更強的毒力。在GDK6-MA病毒中發(fā)生了PB2(E627 K)、PA(I38M)和HA(L111F、H156N和S263R)氨基酸替換。HA的 H156N突變導致MDCK細胞上的空斑增大、病毒在哺乳動物細胞的早期復制增強。PA(I38M)提高了病毒的體外聚合酶活性，但并沒有改變病毒在哺乳動物細胞或小鼠的復制活性。這些單一突變僅對毒力有限的影響。然而，GDK6中HA(H156N、S263R)與PA(I38 M)同時突變可產生毒性更強的突變病毒體。顯示這些突變可以起到PB2(627 K)突變一樣的作用，揭示了H6N6病毒在小鼠致病性方面的新決定因素，這也可能對人類健康構成威脅。應用反向遺傳技術重組病毒，HA中A222V突變，尤其是G228S突變，有助于H6N6病毒與SA-α2,6-Gal受體結合，感染人的H6N1和豬流感H6N6中均出現S228保守性，這表明G228S突變可能促進H6向豬或人的傳播[12]。同時，動物實驗表明，通過直接接觸或吸入含病毒的霧化液滴途徑，該病毒可在雪貂之間有限的傳播。含有2009年新甲型H1N1病毒內部基因的重組H6N6病毒可增加H6N6病毒在雪貂的下呼吸道的復制，但并不出現病毒在雪貂之間的相互傳播[12]。這些結果表明，目前豬源流感病毒H6N6對公眾健康構成一定的風險，我們應密切監(jiān)測其進化和傳播方向。

3 H6N6亞型AIV跨種屬感染人的潛能

禽流感病毒H6N6宿主范圍從禽類擴大到哺乳動物并在其體內有效復制，促使病毒可能跨越物種間屏障傳播人，對人類健康呈潛在威脅。應用血清流行病學調查發(fā)現，美國火雞場暴露人群，如工人和獸醫(yī)，其血清中H6抗體陽性[33-34]。中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所Li等[35]檢測15 689例活禽市場工人、家庭家禽飼養(yǎng)戶農民、大型家禽飼養(yǎng)戶農民、家禽屠宰廠工人、野鳥棲息地工人等多個人群血清中H6抗體，發(fā)現陽性率為0.4%，其中活禽市場工人的抗體陽性率高于大型家禽飼養(yǎng)戶農民，提示人群已被H6亞型禽流感病毒感染，同時活禽暴露是禽流感病毒H6感染人類的主要危險因素。H6N6亞型病毒在歐亞特別我國禽類普遍存在，該病毒雖屬低致病性，但容易與其它流感病毒亞型發(fā)生基因重配，充當感染人類的新型禽流感病毒的先祖。2014年，中國、老撾和越南家禽暴發(fā)高致病性禽流感病毒H5N6亞型，同時發(fā)現該病毒感染人類?；蜻M化分析H6N6病毒為新出現、感染人類的禽流感病毒H5N6提供了NA基因節(jié)段[36]。

4 展 望

H6N6亞型AIV仍屬低致病性流感病毒，僅引起輕微臨床表現，但是最近幾年流行病學調查顯示，H6N6亞型AIV在家禽中的分離率逐漸升高，并易與其它亞型的病毒發(fā)生基因重配形成新型流感病毒。令人擔憂的是，該病毒的進化與傳播速度快，目前其宿主范圍已擴展到哺乳動物并在其細胞內有效復制，促使病毒可能跨越物種間屏障傳播人，對人類健康構成嚴重威脅。禽流感病毒由特異性感染禽類轉變?yōu)樘禺愋愿腥救擞刹《径鄠€關鍵基因決定，特別是HA受體結合特異轉變是流感病毒感染不同物種的先決條件，位于HA蛋白頭部的受體結合位點(Receptor binding sites, RBS)，其主要由190位螺旋、130位環(huán)和220位環(huán)3個結構域組成，具備典型的結合人型受體SA-α-2,6Gal的特征為HA蛋白的226位為L，228位為S[37]；PB2的627位氨基酸是甲型流感病毒宿主范圍以及病毒致病力的重要決定位點，當627位為賴氨酸時毒株致病力強，更適合于感染人類，627位為谷氨酸時毒株致病力弱[38]。我們可通過監(jiān)測這些流感病毒的關鍵氨基酸變異來預警禽流感病毒跨種屬傳播，但是不同亞型流感病毒改變宿主嗜性的分子機制并不相同。因此，深入研究H6N6亞型AIV的起源、進化和傳播方向、宿主范圍的變化，特別是探索感染人的多個關鍵基因的變化，為H6N6亞型禽流感病毒的防控提供科學依據。