田慧敏 尹 元

（赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

絲蓋傘屬（Inocybe）隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales）[1]。該屬的形態(tài)特征主要為子實(shí)體較小，多為斗笠狀菌蓋，深肉桂色至銹色，有鱗片，伸展后菌蓋中間部分凸起，邊緣部分易開裂。菌肉白色。菌褶直生至近延生，淡銹色，褶緣白色。菌柄多為圓柱形，近白色，內(nèi)部實(shí)心，表面有褐色鱗片。孢子淡銹色，表面光滑，近橢圓形。囊狀體有或無，有的頂端有結(jié)晶。菌蓋及菌柄表皮多為整齊排列的菌絲[2]。該屬的成員都為外生菌根菌，與闊葉林和針葉林形成外生菌根，特別是山毛櫸、樺木、楊樹等形成外生菌根，促進(jìn)樹木的發(fā)育，不僅提高木材的產(chǎn)量和質(zhì)量，具有經(jīng)濟(jì)效益，而且具有較高的環(huán)境效益，在生態(tài)系統(tǒng)中起重要作用。由于絲蓋傘屬種類、外形因環(huán)境不同變化大、種內(nèi)變異豐富、分類鑒定難度較大，導(dǎo)致資源利用、中毒救治等方面受限，因此傳統(tǒng)的形態(tài)特征分類鑒定有一定的局限性和主觀性。20世紀(jì)90年代開始國內(nèi)外菌物學(xué)家在大型真菌分子鑒定的方法上做了許多嘗試和探討，ITS以其快速、準(zhǔn)確、簡便等優(yōu)點(diǎn)在大型真菌鑒定中得到了迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，ITS已大量用于對絲蓋傘屬的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及親緣關(guān)系分析中[3-8]。筆者采用形態(tài)學(xué)和ITS片段測序技術(shù)相結(jié)合的鑒定方法對赤峰市不同地區(qū)五個絲蓋傘屬的真菌進(jìn)行鑒定，力求探索絲蓋傘屬真菌的準(zhǔn)確鑒定方法，為真菌的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試4個標(biāo)本均由筆者于2016、2017年采集于赤峰市不同地區(qū)，CFSZ11663（赤峰市松山區(qū)神仙溝風(fēng)景區(qū)楊樹林地，東經(jīng) 118°18′～118°19′，北緯42°06′30″～42°08′30″）、CFSZ13074（赤峰市松山區(qū)城子鄉(xiāng)盔甲山風(fēng)景區(qū)油松林地）、CFSZ10362（赤峰市巴林右旗賽罕烏拉國家級自然保護(hù)區(qū)樟子松林地，東經(jīng)118°18′～118°55′，北緯43°59′～44°27′）、CFSZ11344（赤峰市翁牛特旗五分地鎮(zhèn)巴林橋楊樹林地。采集的標(biāo)本在拍攝生境照片、觀察形態(tài)、測量數(shù)據(jù)、自然干燥、編寫號碼、超低溫冷凍等系列處理之后存放于赤峰學(xué)院生科院菌物標(biāo)本室（CFSZ）。

1.2 形態(tài)鑒定

采用宏觀特征和顯微結(jié)構(gòu)的鑒定方法，宏觀特征采用肉眼觀察、游標(biāo)卡尺測量等方法，需要測量供試樣本的新鮮子實(shí)體大小、顏色、菌柄長度以及直徑、菌蓋直徑。查閱大量文獻(xiàn)進(jìn)行檢索、比對、定種；顯微結(jié)構(gòu)在光學(xué)顯微鏡（奧特BED203）下觀察和測量孢子、擔(dān)子、囊狀體、鎖狀聯(lián)合、菌蓋表皮、菌柄表皮菌絲形態(tài)及大小等，所有數(shù)據(jù)均測量20個，用顯微照相系統(tǒng)（Olympus BX53）拍攝顯微結(jié)構(gòu)相片。

1.3 ITS鑒定

1.3.1 DNA的提取

取干樣品子實(shí)體菌蓋的一小部分研磨，稱量30 mg使用基因組DNA提取試劑盒完成對基因組DNA的提取。

圖1 華美絲蓋傘子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

1.3.2 PCR擴(kuò)增、純化及測序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（eppendorf 5331）上進(jìn)行。

經(jīng)引物ITS1/ITS4進(jìn)行50μL體系PCR擴(kuò)增后，在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。樣品PCR擴(kuò)增之后的產(chǎn)物用Takara膠純化試劑盒純化后，交由生物科技公司完成測序[9]。

1.3.3 ITS序列比對分析

將得到的ITS序列，通過Chromas軟件拼接，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行ITS序列的Blast比對，從檢索的結(jié)果里挑選出同源性比較高的ITS序列，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹的每個分支統(tǒng)計學(xué)顯著性分析以最大似然法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，CFSZ11663為華美絲蓋傘Inocybe splendensR.Heim，CFSZ13074為污白絲蓋傘Inocybe geophylla（Bull.）P.Kumm.，CFSZ10362 為 斑紋絲蓋傘Inocybe maculataBoud.，CFSZ11344為茶褐絲蓋傘Inocybe umbrinellaBres.。

2.1.1 華美絲蓋傘Inocybe splendensR.Heim（內(nèi)蒙古新記錄種）

子實(shí)體偏小;菌蓋直徑1.7～2.0 cm，斗笠狀，深棕色，中間部分顏色較深，表面具呈放射狀縱條紋的纖毛；菌褶彎生，淺灰棕色；菌柄長3.0～4.4 cm，粗0.2～0.7 cm，乳白色至淺棕色（圖1，a、b）。

孢子（9.5～12.0）μm×（5.0～9.0）μm，紡錘形，表面光滑，無色（圖1，c）；擔(dān)子（30.5～34.0）μm×（11.0～12.5）μm（圖 1，d）；側(cè)生囊狀體（55.0～98.0）μm×（24～33.5）μm，腹鼓狀，囊狀體頂端有結(jié)晶（圖1，e）；菌蓋表皮部分菌絲無色，有隔膜，具分支，直徑13.0～19.0 μm，蓋面囊狀體直徑28.5～33.5 μm（圖1，f、g）；菌柄表皮部分菌絲無色，有隔膜，直徑測量得7.0～9.0μm，具鎖狀聯(lián)合（圖1，h）。

該種主要特點(diǎn)為菌蓋棕色，具黃褐色放射狀纖毛，褶側(cè)囊體很大，長達(dá)98μm，菌蓋表皮菌絲膨大呈腹鼓狀寬達(dá)34μm。屬華美組SectionSplendentes鱗毛亞組 supersection“Marginatae”[10]，該種分布于吉林，其他地區(qū)未見報道，為內(nèi)蒙古新記錄種[11]。

2.1.2 污白絲蓋傘紫色變種Inocybe geophyllavar.lilacina（Peck）Gille

子實(shí)體偏小，菌蓋直徑1.2～1.8 cm，斗笠形，污白色具紫色光澤，中部呈現(xiàn)黃色，邊緣為齒狀；菌肉白色；菌褶銹色，直生或彎生，著生較密，菌褶不等長；菌柄長3.7 cm，粗0.2 cm，灰白色，較為光滑（圖2，a、b）。

孢子（7.0～11.5）μm×（4.0～7.0）μm，近橢圓形，表面光滑，淡銹色，有內(nèi)含物（圖2，c）；擔(dān)子（26.0～34.0）μm×（9.5～12.0）μm，無色，棒狀，具四個小梗（圖 2，d）；囊狀體大小為（50.0～62.5）μm×（12.0～23.0）μm，囊狀體壁厚，頂端有結(jié)晶（圖2，e）；菌蓋表皮部分菌絲無色，整齊排列，具隔膜，有分支，具鎖狀聯(lián)合，直徑7.0～10.0 μm（圖2，f、g）；菌柄表皮部分菌絲整齊排列，無隔膜，有鎖狀聯(lián)合，直徑6.5～8.5 μm（圖2，h）。

該種為污白絲蓋傘Inocybe geophylla的變種。主要特點(diǎn)是菌蓋呈淡紫色，菌蓋表皮菌絲不膨大，鎖狀聯(lián)合多，其他特征均一致。該種于1972年被描述定種為Inocybe geophyllavar.lilacina[12]，在我國廣泛分布。

圖2 污白絲蓋傘紫色變種子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

圖3 斑紋絲蓋傘子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

2.1.3 斑紋絲蓋傘Inocybe maculataBoud.

子實(shí)體較大，菌蓋直徑7～8 cm，斗笠形，黃色，有條紋，干后變銹色，邊緣有殘留的菌幕；菌褶淺灰棕色，等長，干后變?yōu)殇P色，遇KOH變黑銹色；菌肉白色；菌柄長度為9 cm，粗約0.8～1 cm，淡黃色，中生（圖3，a、b）。

孢子（7.5～9.5）μm×（5.5～7.0）μm，橢圓形，表面光滑，無色，非淀粉質(zhì)（圖 3，c）；擔(dān)子（21.6～31.2）μm×（7.2～10.1）μm，無色，棒狀，具四個小梗（圖3，d）；沒有囊狀體；菌蓋表皮部分菌絲無色，隔膜均勻，具鎖狀聯(lián)合，直徑6～6.8μm，有膨大菌絲，直徑14.4～31.2 μm（圖3，e）；菌柄表皮部分菌絲整齊排列，無色，有隔膜，直徑6.8～16.4μm。

該種主要特點(diǎn)是菌蓋邊緣具有白色菌幕殘留，褶側(cè)囊體無[13-14]，屬于Inosperma亞屬裂蓋組Rimosae組[15]。

2.1.4 茶褐絲蓋傘Inocybe umbrinellaBres.

子實(shí)體中等大小，菌蓋直徑約4.2 cm，斗笠形，中間部分凸起，頂部茶褐色，邊緣色淺，有棕色片狀鱗片；菌肉白色；菌褶棕色至銹色，不等長，較疏，著生方式為彎生；菌柄長度為10.2 cm，粗約0.4 cm，土黃色，基部膨大（圖4，a、b）。

孢子（9.6～12）μm×（5.3～7.2）μm，橢圓形，表面光滑，銹色，有內(nèi)含物，非淀粉質(zhì)（圖 4，c）；擔(dān)子（23.6～34.1）μm×（9.1～11.8）μm，無色，棒狀，具四個小梗（圖4，d）；褶側(cè)囊體和褶緣囊體均無，菌蓋表皮部分的菌絲無色，存在膨大細(xì)胞（74.4～108）μm×（24～48）μm，其余菌絲整齊排列，具均勻隔膜，直徑7.7～12.3μm（圖4，e）；菌柄表皮部分的菌絲整齊排列，無色，有隔膜，直徑8.4～14.9μm。

圖4 茶褐絲蓋傘子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

圖5 供試樣品和Genbank的最相似物種的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

該種主要特點(diǎn)是菌蓋具有褐色片狀小鱗片，無囊狀體，菌蓋表皮膨大，最寬可達(dá)48μm[16]。在我國分布廣泛。

2.2 rDNA-ITS測序鑒定結(jié)果

2.2.1 四個絲蓋傘屬真菌樣品的ITS測序結(jié)果

PCR擴(kuò)增的4個樣品DNA的ITS序列，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可得出CFSZ11663約為680 bp，登錄號為MG367267；CFSZ13074 約為710 bp，登錄號為 MG367268；CFSZ10362 約為600 bp，登錄號為MG367269；CFSZ10460 約為680 bp，登錄號為MG367270；CFSZ11344 約為700 bp，登錄號為MG367272。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果

對 4個樣本11663、13074、10362、11344的 ITS序列及與其高度相似的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

結(jié)果表明：與5個供試標(biāo)本相似的20個來自Genbank最相似的序列均為絲蓋傘屬（Inocybe）。其中11663與Inocybe splendens聚在一起，結(jié)合宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)將標(biāo)本11663鑒定為華美絲蓋傘（Inocybe splendensR.Heim）。13074與Inocybe geophylla聚在一起，結(jié)合宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)將標(biāo)本13074鑒定為污白絲蓋傘紫色變種[Inocybe geophyllavar.lilacina（Peck）Gille]。10362 與Inocybe maculata聚在一起，結(jié)合宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)將標(biāo)本CFSZ10362鑒定為斑紋絲蓋傘（Inocybe maculataBoud.）。11344與Inocybe umbrinella聚在一起，結(jié)合宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)將標(biāo)本11344鑒定為茶褐絲蓋傘（Inocybe umbrinellaBres.）（圖5）。

3 小 結(jié)

研究將分子鑒定與形態(tài)鑒定相結(jié)合，二者的鑒定結(jié)果基本吻合，11663鑒定為華美絲蓋傘Inocybe splendensR.Heim，13074鑒定為污白絲蓋傘紫色變種Inocybe geophyllavarlilacina（Peck）Gille，10362鑒定為斑紋絲蓋傘Inocybe maculataBoud.，11344鑒定為茶褐絲蓋傘Inocybe umbrinellaBres.。其中Inocybe obsoletaRomagn為中國新記錄種，污白絲蓋傘紫色變種Inocybe geophylla，斑紋絲蓋傘Inocybe maculataBoud.，茶褐絲蓋傘Inocybe umbrinellaBres.為有毒菌類，誤食后會產(chǎn)生神經(jīng)精神型癥狀。研究為菌物資源的鑒定及安全開發(fā)提供依據(jù)，為有毒菌類的準(zhǔn)確鑒定提供了方法。rDNA-ITS序列分析的應(yīng)用隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，會有更廣闊的發(fā)展前景，為真菌的研究提供更加快速、準(zhǔn)確的鑒定方法。