謝元辰 王兆嫻 姚 武 趙 凱 王 娜

(鄭州大學公共衛(wèi)生學院,鄭州450002)

共生微生物(微生物群)定植在人體表面及與外界相同的腔道內，其數量是人體自身細胞的10倍之多，攜帶的基因數量高達人體基因組的100倍[1]。自2007年底美國國立衛(wèi)生院 (NIH) 宣布正式啟動人類微生物組計劃(Humanmicrobiome project,HMP)以來，眾多研究發(fā)現微生物通過與宿主細胞的交互作用調節(jié)局部生理功能，與癌癥、炎癥、自身免疫性疾病、代謝類疾病甚至神經系統(tǒng)等疾病密切相關[2-5]，但目前研究多集中在腸道、陰道、皮膚菌群，對呼吸道菌群的研究還較少。

已有的研究顯示呼吸道微生態(tài)受生命早期接觸、遺傳、宿主易感性、疾病等因素的影響[6-8]，并通過對機體代謝，細胞增殖，炎癥和免疫系統(tǒng)的作用，影響人體健康和疾病的發(fā)展及轉歸。因此本文將從呼吸道微生態(tài)的基本情況、微生態(tài)研究技術及微生物與呼吸道疾病的關聯(lián)性等三個方面展開討論，并對基于微生態(tài)作為治療手段的新思路新方法做出展望。

1 呼吸道微生態(tài)概述

呼吸道分為上呼吸道和下呼吸道，主要功能是進行氧和二氧化碳的交換。成年人氣道的表面積約為70平方米，比皮膚表面積大40倍，整個表面都有特定細菌菌落定植，其中上呼吸道的細菌豐度最高[9]。2014年Dickson等[11]提出了一個島嶼模型，認為呼吸道微生態(tài)是一個梯度變化的過程，肺部的菌群與上呼吸道的相似性很低，且多樣性和豐度也隨著距離口咽部距離的升高而逐漸降低[10,11]。從上呼吸道開始，鼻孔以厚壁菌(Formicates)和放線菌(Actinomyces)為主；口咽部以厚壁菌、變形菌門(Mycetozoan)和類桿菌(Bacteroid)為主[12]；肺部則以擬桿菌屬(Bacaeroides)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Mycetozoan)為主。其中鼻腔微生物群更接近皮膚菌群，對肺部微生態(tài)貢獻很小[13]。

影響呼吸道微生態(tài)結構的原因有很多，其中起決定作用的是微生物進入和被清除(例如咳嗽或免疫防御)出氣道的速度[11]，這對于解釋健康的肺在中毒及精神狀態(tài)改變的情況下，由于咳嗽減少而導致的肺炎有很大意義。除此之外，微生物的繁殖能力、肺部微環(huán)境(如溫度、氧氣張力、pH值、營養(yǎng)密度、局部解剖結構和宿主防御能力)、微生物的早期定植以及年齡都對肺部的菌群結構有很大影響[14,15]。

2 微生態(tài)研究技術

由于99%的人體微生物都是不能被培養(yǎng)的[16]，因此傳統(tǒng)的菌種培養(yǎng)鑒定方法存在著很大的局限性。具體表現為無法區(qū)分許多在生理生化特征上相似的種屬且不能完整地反映整個微生物群落的組成和動態(tài)變化。隨著對rRNA小亞基和宏基因組測序的廣泛應用，使得探明微生態(tài)結構、預測微生物功能和分析微生物作用靶點成為現實。

目前，在微生物領域里應用最為廣泛的兩種宏基因組測序策略分別是16S rRNA擴增子測序和全基因組測序。16S rRNA擴增子測序通過利用特定的“探針”錨定目標高變區(qū)的位置，并將對應的堿基序列進PCR擴增和測序[17]。測序完成后，將提取的堿基序列進行數據的預處理(包括測序質量控制、雙端序列連接、混合樣本)后，根據16S rRNA 基因序列的相似度閾值通過聚類分析而得到不同分類水平的分類單元(taxon)，并對其進行注釋得到操作分類單位(OTU)，從而了解微生物的結構(包括豐度、多樣性及不同群落的差異特征等信息)[18]。全基因組測序(WGS)則是將基因組 DNA “打斷”成多個片段，對這些分子片段進行直接測序，然后將預處理(包括測序質量控制和“污染”序列剔除)后的數據進行分析，了解整個微生物群落的結構，包括功能組成、系統(tǒng)進化、生物多樣性及不同群落的差異特征等信息，還可對重要物種及基因進行個性化分析[19]。

目前新出現的第三代測序技術已經開始嶄露頭角，其核心技術是單分子測序，無需進行PCR擴增，克服了第二代測序技術讀長短及系統(tǒng)性錯誤等問題，實現了實時測序。在測序長度(平均讀長可以達到8 kD～15 kD)、速度、通量、高CG含量及重復序列等復雜結構的測序方面有巨大的優(yōu)勢[18,20]。當測序深度達到70倍以上，經過平臺自身及HGAP、pacbioCA、LSC、p-errormolule、PBcR等相關軟件的矯正后，錯誤率可降低到0.1%以下[21]。

測序技術的發(fā)展雖然在很大程度上推動了微生態(tài)的研究，但由于研究菌群與宿主細胞間作用的機制仍然需要動物及細胞實驗的數據支持，因此微生物的培養(yǎng)和純化對微生物的研究具有不可替代的地位。近年來涌現了許多改善微生物培養(yǎng)的新方法，如稀釋培養(yǎng)法(Dilution culture)[22]、高通量培養(yǎng)技術(High-throughput culti-vation,HTC)[23]、模擬自然環(huán)境的培養(yǎng)技術[24,25]、改良微生物培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件[26]、設計新型的培養(yǎng)基等方法。除此之外，Matthew等還創(chuàng)建了一個基于細菌或古菌16S rRNA的序列預測目標微生物培養(yǎng)基配方的數據庫-GROWREC，該數據庫結合了NCBI的微生物分類和微生物培養(yǎng)基數據庫(DSMZ)的數據，依據傳遞預測模式(Transitive prediction schema)和協(xié)同過濾預測(Collaborative filtering predictor)，根據已知物種培養(yǎng)基來推斷其相似性高的近緣物種培養(yǎng)基，因此極大加速了從生態(tài)研究到微生物資源挖掘的進程[27]。

3 微生態(tài)與呼吸道疾病

3.1肺癌 隨著測序技術的發(fā)展和應用，研究發(fā)現癌癥與微生物之間具有復雜的調控關系，雖然癌癥的危險因素通常被認為是宿主遺傳學和環(huán)境因素，但實際上微生物約涉及20%的人類惡性腫瘤[28]。研究發(fā)現肺癌患者的微生物多樣性顯著低于正常人群，但鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、奈瑟菌屬(Neisseria)、韋榮球菌屬(Veillonella)、巨球型菌屬(Megasphaera)、厚壁菌門(Firmicutes)和TM7菌門的豐度卻明顯高于正常對照組[29]，進一步的研究發(fā)現金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的感染是導致肺癌病人患敗血癥的主要原因[30]。

炎癥級聯(lián)反應的激活是肺癌發(fā)生的早期步驟，可刺激生長因子和細胞因子如TGF-β，IL-1和IL-8的合成[31]。一旦癌癥形成，炎癥還會進一步促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[32]。對大多數人來說，可以快速修復被破壞的屏障，使得內環(huán)境穩(wěn)態(tài)得以恢復，但在宿主免疫力低下或微生物恢復力差的情況下會導致屏障的破壞和內穩(wěn)態(tài)的失衡[33]。Gui等[34]利用Lewis肺癌小鼠模型在研究腸道微生物的抗腫瘤作用時發(fā)現，ABX(萬古霉素，氨芐青霉素和新霉素的抗生素混合物)可以通過上調VEGFA的表達和下調BAX和CDKN1B的表達來部分損害順鉑的功能，但在順鉑聯(lián)合乳酸桿菌共同治療后發(fā)現小鼠CD8+T 細胞的 IFN-γ、GZMB和PRF1表達被上調，增強了順鉑的抗腫瘤生長和促凋亡作用，與此同時Boursi等[35]的研究也發(fā)現使用青霉素、頭孢菌素或大環(huán)內酯類藥物可通過破壞菌群的生態(tài)平衡而增加肺癌的患病風險。

細菌毒素還可以通過直接損害宿主DNA，促進肺癌的發(fā)生。研究發(fā)現細菌可以通過宿主產生的活性氧和氮物種直接或間接損傷DNA。當DNA損傷超過宿主細胞的修復能力時，細胞就會發(fā)生死亡或突變[36,37]。肺炎支原體是常見的呼吸道病原體，可調節(jié)宿主細胞的凋亡和生長。目前已經發(fā)現三種肺炎支原體損傷宿主DNA的機制：①肺炎支原體感染肺上皮細胞后，可通過炎癥反應誘導活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)形成，利用ROS誘導DNA的損傷[38]；炎癥導致的細胞損傷及修復可加快細胞的分裂速度，提升DNA突變的風險[39]；肺炎衣原體也是宿主單核細胞中IL-1β和IL-6的誘導劑，具有潛在的致癌作用[40]。Khan等[41]還進一步發(fā)現了肺炎衣原體的DNA核靶向序列，包括exonuclease V subunit RecB、ribonuclease R、exodeo-xyribonuclease VII small subunit和 exodeoxyribonu-clease VII large subunit，并且發(fā)現錯配修復蛋白的改變可能與肺癌有關[41]。

3.2肺纖維化 肺纖維化屬于肺間質病，早期表現為彌漫性炎癥，后期則表現為成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質(ECM)進行性沉積[42]。肺纖維化是一種不可逆的肺部損傷疾病，最終可導致彌漫性間質性肺纖維化及肺功能的喪失，死亡率高達50%～70%[43,44]。

大量的動物和臨床研究均證實細菌感染是引起急性肺損傷纖維化的重要原因，可引起氣道上皮細胞的損傷和凋亡，調節(jié)宿主對損傷的反應能力[45]。在肺纖維化病人中，通過對細菌DNA高變區(qū)進行二代測序后發(fā)現，患病組的細菌豐度是對照組的兩倍，且嗜血桿菌(Hemophilus)、假單胞菌(Pseudomxon-as)、球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococ-cus)、奈瑟菌屬(Neisseria)、和韋榮球菌屬(Veillonella)的豐度顯著上升，結果顯示這些菌群可潛在推動疾病的發(fā)展[46,47]。在針對小鼠的實驗中發(fā)現，巨噬細胞功能的發(fā)揮和黏膜纖毛對細菌的有效清除均需要Muc5b糖蛋白的參與[48]，一旦黏膜纖毛清除功能受損會使得細菌在下呼吸道持續(xù)存在，使其作為一個潛在的啟動器損傷肺泡，加速細菌感染，持續(xù)惡化病情。此外，還有研究指出肺炎鏈球菌可通過分泌肺炎球菌溶血素(ply)，破壞肺組織屏障并抑制免疫和炎癥細胞的作用，驅動肺纖維化的發(fā)展。實驗表明在小鼠感染肺炎鏈球菌后的24 h和48 h后，用克拉霉素或阿莫西林進行抗生素治療，可顯著降低羥脯氨酸含量，進一步證明了肺部微生態(tài)失衡是肺纖維化的一個致病因素[49]。

3.3慢性阻塞性肺疾病(COPD) COPD是最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一[50]，它包括慢性支氣管炎、小氣道疾病、黏液分泌過多和肺氣腫等表型[51]，主要表現為持續(xù)的氣道炎癥，小氣道閉塞和肺泡破壞導致的肺功能受損[52]。COPD常見的定植細菌有流感嗜血桿菌(H.influenzae)、卡他莫拉菌(M.cata-rrhalis)和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)[53]，但由于細菌菌群通常在菌株和菌種方面會發(fā)生變化，因此認為其定植細菌是動態(tài)變化的[54]，且急性的細菌或病毒感染通常被認為是COPD惡化的觸發(fā)器[55]。臨床數據顯示，在急性COPD惡化期間用抗生素治療7～10 d可以降低治療失敗和院內死亡的風險，說明細菌感染是導致COPD突然惡化的重要原因之一[56]。

目前，針對微生物在COPD炎癥進展中的作用機制也有一些研究[57-59]。Richmond等[57]通過用免疫球蛋白受體缺陷型(pIgR-/-)小鼠構建的COPD模型發(fā)現，相比于正常的pIgR-/-小鼠，無菌的pIgR-/-小鼠體內缺乏分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)，不能推動氣道重塑、肺氣腫和炎癥水平的升高，說明細菌介導了COPD的進展。Hinks等[60]發(fā)現未分型流感嗜血桿菌(Nontypeable-H.influenzae，NTHi)的感染可以誘導黏膜相關恒定的T淋巴細胞(MAIT)限制性分子MR1在肺巨噬細胞上的表達和MAIT細胞的IFN-γ應答。Millares等[61]對具有代表性的8個COPD患者的痰標本進行宏基因組測序和MG-RAST分析后發(fā)現微生物組的代謝能力在癌癥和碳水化合物的代謝過程中顯著上升，而在細胞的生長、死亡以及能量的運輸和分解過程中則顯著下降?？梢钥闯鑫⑸锟赏ㄟ^多種途徑影響COPD的發(fā)展和轉歸。

3.4哮喘 哮喘是一種由多因素引發(fā)的疾病，主要特征是氣道炎癥升高，平滑肌增生和氣道高反應性[52,62]。傳統(tǒng)觀點認為室內的塵螨、蟑螂、老鼠、寵物以及室外的樹木、草、花粉等過敏原都是致兒童哮喘的危險因素[63-65]。然而，最近從流行病學、臨床資料以及小鼠模型中獲得的研究數據均顯示微生物在哮喘發(fā)病的過程中具有關鍵作用[66-68]。

在生命的頭幾個月，細菌的定殖對免疫系統(tǒng)的發(fā)育和平衡至關重要：它促進黏膜免疫應答的成熟，建立免疫耐受并在致病菌感染時幫助激活免疫系統(tǒng)[69-71]。Bisgaard等[72]對411名嬰兒進行前瞻性研究發(fā)現，如果無癥狀新生兒在一月齡時呼吸道被肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、卡他莫拉菌(Moraxelle catarrhalis)中的一種或多種細菌聯(lián)合定植，其首次發(fā)生持續(xù)性喘息和喘息急性發(fā)作的時間將會顯著提前，且血液嗜酸性粒細胞計數上升和總IgE增加的風險會上升1～3倍，并且最終可能導致嬰幼兒氣道阻力的增加，增加嬰兒患哮喘的風險[73]。研究提示：①嬰幼兒肺部微生態(tài)結構的建立是一個動態(tài)過程；②微生物群與肺特異性免疫發(fā)展之間的關系是動態(tài)的。

不僅如此，呼吸道微生態(tài)還可以從多個方面影響哮喘的發(fā)展以及轉歸。Remot等[74]發(fā)現無菌小鼠和SPF級小鼠在同樣的干預下，兩組小鼠的疾病進程沒有區(qū)別，進一步將從患病小鼠中篩選菌株聯(lián)合致哮喘干預后發(fā)現，CNCM I 4969可防止肺部炎癥，保護小鼠免于塵螨(House Dust Mice,HDM)誘導的氣道疾病，而CNCM I 4970則會加重小鼠肺部的炎癥。Depner等[75]則發(fā)現鼻腔中菌群多樣性的減少會增加兒童患哮喘的風險，并且Gibson等[76]的研究則通過抗生素的治療印證了這一結論，在一項隨機、雙盲、安慰劑病例對照研究中發(fā)現，對以長期吸入皮質類固醇進行治療的哮喘患者(沒有聽力障礙或QTc的異常延長)，用阿奇霉素(500毫克，每周3次，持續(xù)48周)聯(lián)合皮質類固醇治療，可以降低哮喘急性發(fā)作的頻率，提高生活質量。

4 微生態(tài)的應用的前景

目前，許多研究致力于將細菌作為生物標志應用于呼吸道系統(tǒng)疾病的早期診斷。針對肺癌的研究顯示，在誘導痰中發(fā)現的腸球菌屬(Enterococcussp)、中鏈球菌(Streptococcus intermedius)、大腸桿菌(Escherichia coli)、甲型鏈球菌(S.viridans)的豐度與肺癌的進展有關[77]，另一研究發(fā)現將唾液中的韋榮球菌屬(Veillonella)和噬二氧化碳菌屬(Capnocytophaga)的豐度作為指標聯(lián)合判別是否患有肺癌[包括鱗狀細胞癌和腺癌]，其ROC值達到0.86，靈敏度為84.6%，特異性為86.7%[77]。 在針對特發(fā)性肺纖維化病人的研究中也發(fā)現鏈球菌(Streptococcus)、普氏菌屬(Prevotella) 和梭菌屬(Fusobacterium)豐度的特異性上升也可以作為獨立生物指標預測疾病的進展[10]。但由于這一類研究的樣本量仍然較少，因此距離臨床應用還有一段距離。

隨著對微生物研究的深入，人們發(fā)現在免疫治療領域擁有巨大的應用潛力[74,78,79]。研究發(fā)現“檢查點抑制劑”作為一種喚醒免疫系統(tǒng)抵抗腫瘤的新型藥物，在應用于臨床治療時卻發(fā)現對部分病人沒有效果，其中Vétizou等[80]用CTLA-4阻斷劑(CTLA-4會影響人體的免疫系統(tǒng)，削弱其殺死癌細胞的能力)進行抗腫瘤治療時發(fā)現，T細胞對擬桿菌(B.thetaiotaomicron)或脆弱擬桿菌(B.fragilis)的應答與CTLA-4的阻斷功能相關，動物實驗進一步顯示用脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis)對無菌小鼠或用抗生素進行干預后的小鼠進行管飼，可以改變其對CTLA-4阻斷劑治療沒有反應的問題，同時，大量研究也發(fā)現CpG寡核苷酸免疫對小鼠皮下腫瘤的治療效果在無菌小鼠和經過高劑量的抗生素處理之后的小鼠中被降低，這一現象在黑素瘤、膀胱癌、腎部癌癥和肺癌的研究中也發(fā)現了類似現象，但在結腸癌(微生物豐度、多樣性都很高)中卻沒有發(fā)現類似結果[57,81]，提示在臨床應用“檢查點抑制劑”治療腫瘤時應考慮將微生物作為免疫治療佐劑，提升免疫療法的療效。同時也提示除了基因組之外，微生物的個體差異會對疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療產生巨大的影響[82]。

用基因工程的方法(如對細菌基因組進行敲除、敲入或引入突變)，使外源基因得到高效表達的細菌一般稱為“工程菌”，工程菌作為合成生物學 (Synthetic biology，SB)研究的一個重要領域，在醫(yī)學中也有廣泛的應用前景，可以作為“藥物”的生產場所及運輸載體對疾病進行治療[83-86]。Ro等[87]創(chuàng)造了一種釀酒酵母菌株，其通過表達紫穗槐二烯合酶，啟動焦磷酸法尼酯(Farnesyl pyrophosphate，FPP)的生物合成途徑，增加FPP的產量，從而產出大量的青蒿酸(青蒿素前體)；與此同時，細菌在藥物傳送方面也有很大潛力，與已經用于癌癥治療的病毒相比，細菌攜帶非天然DNA的能力明顯更強。因此，原則上細菌可以作為有效藥物輸送載體，攜帶基因電路(Genetic circuits)編碼提升治療的有效性[85]。Claesen等[88]采用模塊化的設計策略，在體外利用大腸桿菌將大分子物質轉染至癌細胞的細胞質。鑒于整個系統(tǒng)的高度復雜性，他們構建了五個功能模塊：產生用于遞送大分子的有效載荷裝置(a payload device，PLD)，啟動細菌入侵哺乳動物細胞的裝置(Invasion device，ID)，響應于液泡微環(huán)境的液泡感測裝置(Vacuole sensing device,VSD)，引起細菌裂解的自溶裝置(Self-lysis device,SLD)和液泡裂解裝置(Vacuole lysis device,VLD)，結果顯示將各模塊進行系統(tǒng)優(yōu)化后的大腸桿菌能夠將80%蛋白質靶向傳送至癌細胞。工程菌治療作為一個新興的研究領域，雖然迄今為止已經設計了幾個系統(tǒng)性的驗證概念，但下一代的設計預計將更加復雜，包括診斷、信號集成、決策、復合生產、靶向遞送以及安全模塊[88]。

綜上所述，微生態(tài)作為人體的第二套“基因組”，從方方面面影響著人體的健康，同時作為呼吸道疾病治療的潛在靶點，具有重要的研究價值。但目前對于微生物與宿主相互作用的機制、免疫治療的效果與微生態(tài)間的作用機制、如何建立一種安全、規(guī)范、操作性強的微生物移植方式及稀有菌群對人體的健康的作用等問題仍有巨大的研究空間。