盧靖珊，楊 漸,2，許 盈,2，俞昌喜,2

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2. 福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為持續(xù)性的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨損傷[1]。患病率較高，全球約為0.5%～1.0%，我國患病率約為0.3%～0.4%，主要患病年齡為40～60歲，女性高發(fā)，患病率約為男性的3倍[2]。該病導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的漸進(jìn)性破壞，病情嚴(yán)重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵硬、關(guān)節(jié)畸形、關(guān)節(jié)強(qiáng)直，甚至關(guān)節(jié)脫位，致殘率極高，若未及時(shí)進(jìn)行診斷治療，患者將喪失勞動(dòng)能力，給社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于RA的病因不明，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，對RA的深入研究有助于進(jìn)一步深入理解RA的病理生理學(xué)特點(diǎn)，以及進(jìn)一步尋找其潛在的診斷或治療靶標(biāo)。近年來，越來越多的學(xué)者將新興的代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于RA的研究中，現(xiàn)就其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 代謝組學(xué)研究技術(shù)的概述

代謝組學(xué)是從20世紀(jì)末開始迅速發(fā)展起來的，對某一生物或細(xì)胞中小分子內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析的一門新興學(xué)科。作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，代謝組學(xué)繼承了基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的“組學(xué)”研究思路，生物體內(nèi)所有的代謝產(chǎn)物都需要分析，即從整體上研究機(jī)體受外界環(huán)境干擾后，其內(nèi)源性代謝產(chǎn)物種類及數(shù)量的變化規(guī)律，全面地體現(xiàn)生物體對相應(yīng)刺激的響應(yīng)機(jī)制，具有即時(shí)、靈敏、全面等特點(diǎn)。其分析手段主要是應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)(如核磁共振、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用等)，定性、定量地檢測生物樣本中的小分子內(nèi)源性代謝物，通過結(jié)合化學(xué)信息學(xué)等技術(shù)，考察生物體在生理及病理狀態(tài)下或藥物干預(yù)前后，其內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，尋找到疾病潛在的具有特異性的生物標(biāo)記物，從而闡明藥物的作用機(jī)制、揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，為疾病的診斷與治療提供參考[3]。

2 代謝組學(xué)在RA相關(guān)研究中的應(yīng)用

2.1 揭示RA的早期生物標(biāo)志物RA早期生物標(biāo)志物是從機(jī)體血液或其他體液、組織液中發(fā)現(xiàn)的某種成分，作為RA的一種發(fā)生信號(hào)，能用于健康人群的篩檢及RA患者的早期診斷和治療反應(yīng)預(yù)測[4]。利用代謝組學(xué)的研究方法，尋找具有特征性的RA早期生物標(biāo)志物，是代謝組學(xué)在RA研究中主要的目的。

目前，國內(nèi)外針對RA早期生物標(biāo)志物的代謝組學(xué)研究非常有限。C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是一種急性蛋白，當(dāng)機(jī)體受到感染或組織損傷時(shí)，其含量會(huì)急劇上升，以清除入侵機(jī)體的物質(zhì)，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為CRP是一種非特異性的炎癥標(biāo)志物。Young等[5]采用基于核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技術(shù)的代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)早期RA患者血清中的CRP較健康人群明顯增多，通過結(jié)合早期RA的癥狀及含量異常的代謝物等因素，可對早期的RA進(jìn)行分期。Surowiec等[6]采用LC-MS的代謝組學(xué)研究方法，分析30例RA早期患者和19例健康人群的代謝物譜。研究發(fā)現(xiàn)，在RA早期患者的血漿樣本中可以檢測到脂類物質(zhì)的變化，神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin，SM)與溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidyl- choline，LPC)的含量在RA早期患者體內(nèi)較對照個(gè)體內(nèi)處于更高的水平，且隨著RA的發(fā)生與發(fā)展，SM與LPC的含量也逐漸上升，提示SM與LPC是疾病強(qiáng)有力的預(yù)示因子，可用于反映疾病的病程進(jìn)展。另有學(xué)者指出，SM與LPC在早期骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者體內(nèi)的含量也異常升高，在鑒別診斷早期RA與早期OA上，未找到差異性物質(zhì)[7]。Michopoulos等[8]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)的代謝組學(xué)研究方法，在Tg197轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠模型上進(jìn)行RA的相關(guān)研究。通過小鼠的后肢提取物代謝譜圖發(fā)現(xiàn)，對照組(野生型健康小鼠)和Tg197小鼠之間的代謝表型具有明顯的差異，甲叉琥珀酸(itaconic acid)僅在Tg197小鼠中檢測到，表明甲叉琥珀酸與RA的發(fā)生有直接聯(lián)系。當(dāng)Tg197小鼠接受抗RA生物藥英夫利昔單抗治療時(shí)，其體內(nèi)甲叉琥珀酸的濃度變化有所減緩甚至逆轉(zhuǎn)，從而發(fā)現(xiàn)RA潛在的早期生物標(biāo)志物甲叉琥珀酸。隨后，為進(jìn)一步確證甲叉琥珀酸為RA的早期生物標(biāo)志物，并評估由動(dòng)物模型得出的結(jié)論與人體的相關(guān)性，作者通過對18例RA患者的人成纖維細(xì)胞進(jìn)行人腫瘤壞死因子(human tumor necrosis factor，hTNF)處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)hTNF處理的人成纖維細(xì)胞內(nèi)存在大量的甲叉琥珀酸，而其對照組中未檢測到。研究顯示，甲叉琥珀酸在所有受檢標(biāo)本中均與疾病表型有很強(qiáng)的相關(guān)性，證實(shí)了甲叉琥珀酸在RA早期診斷的價(jià)值，為RA的早期診斷提供了理論依據(jù)。

2.2 發(fā)現(xiàn)RA標(biāo)志物逆推完善通路機(jī)制眾所周知，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分別是從基因與蛋白質(zhì)的水平來研究生物體生命活動(dòng)的學(xué)科。然而，機(jī)體內(nèi)有許多生命活動(dòng)與代謝物的含量密切相關(guān)。代謝物可反映生命過程中發(fā)生的一系列的生物化學(xué)反應(yīng)，代謝物的變化正是機(jī)體體內(nèi)變化過程的反映。利用代謝組學(xué)尋找到RA潛在的生物標(biāo)志物，通過其代謝通路逆推找出其調(diào)節(jié)酶和調(diào)控基因，完善疾病的通路機(jī)制，對RA發(fā)病機(jī)制的深入理解具有重要的指導(dǎo)意義。

NLRP3炎性小體是固有免疫的重要組成成分，在機(jī)體的免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用，Guo等[9]報(bào)道了NLRP3與RA的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。Pang等[10]在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠中進(jìn)行甲氨蝶呤對RA炎癥抑制作用的代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤主要是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和NLRP3/caspase-1通路，下調(diào)通路相關(guān)的細(xì)胞因子水平，抑制促炎性脂質(zhì)的釋放，促進(jìn)抗炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)，減輕CIA大鼠的炎性腫脹，抑制關(guān)節(jié)組織炎癥的發(fā)生。

Yang等[11]通過代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，RA的發(fā)病機(jī)制可能與能量代謝異常有關(guān)，進(jìn)一步通過定量檢測與能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在RA患者體內(nèi)磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDHA)等厭氧分解代謝酶有所上調(diào)，而有氧氧化和脂肪酸氧化的酶有所下調(diào)(如檸檬酸合成酶、二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)琥珀酰酶、磷酸葡萄糖酸脫氫酶、長鏈脂酰CoA合成酶、長鏈烯脂酰輔酶A脫氫酶等)。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)可參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，改善機(jī)體的炎癥狀態(tài)，通過敲低HIF-1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)成纖維樣滑膜細(xì)胞中的有氧氧化酶和脂肪酸氧化酶的表達(dá)減少，而厭氧分解代謝酶的表達(dá)有所增加。研究結(jié)果表明，滑膜液中葡萄糖和乳酸可用作診斷RA的可靠生物標(biāo)志物，由HIF-1α通路調(diào)節(jié)的厭氧分解代謝增強(qiáng)和有氧代謝減少是促進(jìn)RA進(jìn)展的重要因素。該研究利用代謝組學(xué)技術(shù)，完善了從代謝物到上游調(diào)節(jié)酶與調(diào)控基因的通路機(jī)制。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是一種由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，能夠抑制成骨細(xì)胞及刺激破骨細(xì)胞的細(xì)胞因子，多項(xiàng)研究指出，TNF是治療RA的一個(gè)重要靶標(biāo)[12]。Narasimhan等[13]應(yīng)用基于1H-NMR的代謝組學(xué)研究方法，分析19例RA患者的血清代謝物譜，尋找與滑膜標(biāo)記基因表達(dá)相關(guān)的血清代謝物，研究提示血清中的代謝物與滑膜組織中的細(xì)胞因子簇具有一定的相關(guān)性。血清中膽堿和葡萄糖水平與滑膜組織中TNF-α和CD3分化簇(cluster of differentiation3，CD3)基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，血清中琥珀酸酯通過抑制脯氨酸而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)，與滑膜組織中的IL-1β基因的表達(dá)呈正相關(guān)。研究結(jié)果提示，除TNF-α外，滑膜組織中的CD3ε和IL-1β基因的表達(dá)也與RA的發(fā)病密切相關(guān)。研究表明，代謝物不僅可以作為炎癥滑膜組織引起的紊亂的生物標(biāo)志物，還可以用于預(yù)測滑膜組織中與RA相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)而完善RA發(fā)病的通路機(jī)制，充分說明了代謝組學(xué)技術(shù)在RA發(fā)病機(jī)制研究中的獨(dú)特優(yōu)勢和潛力。

2.3 闡明RA疾病的發(fā)病機(jī)制RA的發(fā)病與多種因素相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，要探究復(fù)雜的RA發(fā)病機(jī)制需要對機(jī)體的代謝物組有全面的了解。利用代謝組學(xué)技術(shù)全面、即時(shí)、靈敏的研究特點(diǎn)與優(yōu)勢，從代謝角度闡明RA的發(fā)病機(jī)制，更系統(tǒng)全面地揭示RA的發(fā)病機(jī)制。

2.3.1RA發(fā)病與能量代謝異常相關(guān) 乳酸、丙酮酸、檸檬酸等是與能量代謝過程有關(guān)的產(chǎn)物，Zheng等[14]采用佐劑關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis，AIA)大鼠模型模擬人體急性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，發(fā)現(xiàn)AIA大鼠體內(nèi)的丙酮酸、乳酸水平相對升高，而檸檬酸的含量相對減少。在氧供應(yīng)相對不足時(shí)，機(jī)體通過葡萄糖不完全分解生成乳酸提供能量，乳酸水平的升高說明了AIA大鼠體內(nèi)的糖無氧酵解異常加強(qiáng)。檸檬酸是三羧酸循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，檸檬酸含量的相對減少提示AIA大鼠體內(nèi)的糖有氧代謝部分受到抑制。Shan等[15]在CIA大鼠上同樣觀察到能量代謝紊亂的現(xiàn)象。此外，Yang等[11]通過分析比較25名RA患者和10名健康受試者的滑膜液樣品，發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜液中葡萄糖、檸檬酸的濃度相對減少，而乳酸濃度明顯升高，提示RA代謝物質(zhì)差異的產(chǎn)生機(jī)制與無氧酵解和有氧代謝的失衡相關(guān)。由此可見，RA的發(fā)病機(jī)制可能與能量代謝異常有關(guān)。

2.3.2RA發(fā)病與脂質(zhì)代謝異常相關(guān) 據(jù)報(bào)道，RA患者的心血管病死率是普通人的2倍，尤其是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的患病風(fēng)險(xiǎn)增加，提示RA發(fā)病可能與脂質(zhì)代謝異常有關(guān)。歐陽昕等[16]應(yīng)用基于NMR譜的代謝組學(xué)研究方法，對30例RA患者及35名健康人進(jìn)行了評估，脂質(zhì)譜分析顯示，RA患者體內(nèi)存在一定程度的脂質(zhì)代謝紊亂，其血清中高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、膽固醇和磷酸膽堿(phosphatidyl choline，PC)的含量相對減少，而低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)的含量相對增高。研究結(jié)果表明，膽固醇、乳酸、乙?；堑鞍缀椭|(zhì)是RA的候選生物標(biāo)志物。HDL可將蓄積于末梢組織中的游離膽固醇與血液中的脂蛋白運(yùn)送到肝臟組織，以維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的相對恒定，HDL含量的減少，使膽固醇在體內(nèi)累積，促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。體內(nèi)的LDL主要由VLDL轉(zhuǎn)變而來，其主要功能是運(yùn)載膽固醇進(jìn)入全身各組織細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體內(nèi)的LDL過量時(shí)，它所運(yùn)載的膽固醇便會(huì)積存于血管壁上，對血管內(nèi)膜造成炎癥樣刺激，從而加速了RA的發(fā)生和發(fā)展。此外，Giera等[17]通過脂質(zhì)組學(xué)，定量分析RA患者滑膜液中溶血卵磷脂與卵磷脂類的含量波動(dòng)，佐證了RA的發(fā)病與體內(nèi)脂質(zhì)代謝的異常相關(guān)?；ㄉ南┧?arachidonicacid，AA)是人體的一種必需脂肪酸，是多種生物活性物質(zhì)的前體，具有重要的生物學(xué)作用，Wang等[18]在AIA大鼠上觀察AA代謝的變化，發(fā)現(xiàn)AIA大鼠在環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)和脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)催化的AA代謝途徑中，有19種代謝產(chǎn)物較正常組明顯增加，治療后則恢復(fù)到正常水平。Ding等[19]采用CIA大鼠進(jìn)行血清代謝組學(xué)的研究，同樣發(fā)現(xiàn)了AA代謝紊亂的現(xiàn)象，提示RA的發(fā)病機(jī)制可能與AA和磷脂代謝網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)有關(guān)。另外，Pang等[10]通過血漿代謝組學(xué)的研究方法，對CIA大鼠的代謝變化進(jìn)行全面的評價(jià)，亦發(fā)現(xiàn)RA的發(fā)病與AA、亞油酸和鞘脂代謝異常相關(guān)。

2.3.3RA發(fā)病與氨基酸代謝紊亂相關(guān) 甘氨酸(glycine，Gly)是許多代謝反應(yīng)中的關(guān)鍵化合物，甘氨酸受體(glycine receptor，GlyR)是一種重要的抑制性受體，分布在各細(xì)胞膜上(如單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)，并參與體內(nèi)的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。Gly可通過與其受體結(jié)合，抑制這些細(xì)胞的活性，從而發(fā)揮抗炎作用。?；撬嵩诳寡趸?、維持膜穩(wěn)定和調(diào)節(jié)滲透壓等生物過程中起著重要的作用，可直接清除氧自由基，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。Yun等[20]發(fā)現(xiàn)，CIA大鼠血清Gly水平明顯下降，而?；撬崴矫黠@升高，紊亂的氨基酸代謝水平提示CIA大鼠體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)。Li等[21]采用LC-MS的代謝組學(xué)研究方法，測定30例RA患者和32例健康對照者的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)RA患者血清中的谷氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-脯氨酸明顯升高，而色氨酸、精氨酸的含量則明顯下降。有研究報(bào)道，谷氨酸可能是RA的一種新的預(yù)測因子，與早期骨侵蝕有關(guān)[22]。色氨酸可以反映膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的存在和嚴(yán)重程度，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[23]，色氨酸代謝的增加，提示了其機(jī)體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)提示，RA患者體內(nèi)的氨基酸分解代謝異常增強(qiáng)，紊亂的氨基酸分解代謝與炎癥關(guān)節(jié)的低氧狀態(tài)，限制了葡萄糖和其他大分子從血液擴(kuò)散進(jìn)入滑膜，導(dǎo)致脂質(zhì)降解增加，酮體在滑膜內(nèi)富集，最終致使RA的發(fā)生。

2.3.4RA發(fā)病與機(jī)體氧化應(yīng)激相關(guān) 氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，抗氧化能力相對不足，機(jī)體的自由基異常增多，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，從而引起細(xì)胞和組織的損傷。Kim等[24]通過對RA和其他類型關(guān)節(jié)炎(強(qiáng)直性脊柱炎、貝特病和痛風(fēng))患者的滑膜液樣品進(jìn)行代謝分析，發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織內(nèi)的谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶含量相對減少，機(jī)體的抗氧化能力減弱，且自由基大量堆積，過量的自由基破壞了軟骨細(xì)胞，使滑膜與骨質(zhì)受損，最后導(dǎo)致RA的發(fā)生。He等[25]采用代謝組學(xué)結(jié)合超微弱光子發(fā)射(ultra weak photon emission，UPE)技術(shù)，研究CIA小鼠的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激的關(guān)系。這些研究顯示，RA的炎癥反應(yīng)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)的血漿代謝產(chǎn)物的升高、胺代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)性減少密切相關(guān)。ROS是機(jī)體在有氧代謝過程中的產(chǎn)物，過高的ROS水平會(huì)對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)造成損壞[26]，高濃度的ROS可通過未配對的自由基氧化各細(xì)胞及細(xì)胞外的部分，破壞細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸分子的丙烯雙鍵，使細(xì)胞膜的流動(dòng)性與通透性發(fā)生變化，最終使細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)破壞和功能紊亂，加劇機(jī)體的炎癥反應(yīng)，促使RA的發(fā)生。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，代謝組學(xué)技術(shù)憑借其高靈敏度、高準(zhǔn)確度及全面性的研究特點(diǎn)和優(yōu)勢，在RA的早期診斷方面具有更好的可靠性和預(yù)見性，使快速的臨床干預(yù)成為可能，為RA的預(yù)防、早期診斷和治療提供新的思路。從代謝角度揭示RA的發(fā)病機(jī)制，對輔助臨床RA的診斷及治療具有重大的指導(dǎo)意義。未來隨著檢測技術(shù)和生物信息技術(shù)的不斷改進(jìn)與發(fā)展，代謝組學(xué)的研究方法不僅有望成為臨床診斷RA的新工具，而且有助于理解該病發(fā)生的病理機(jī)制、觀察其病情的發(fā)展與預(yù)后，具有廣闊的應(yīng)用前景。