史馨瑾，孫海偉，王 俊，陳鴻軍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

流感病毒（Influenza virus）屬于正黏病毒科，具有負(fù)股單鏈分段的RNA基因組。根據(jù)病毒內(nèi)部蛋白抗原性不同，分為A、B、C、D型，絕大多數(shù)季節(jié)性流感均與A、B兩種血清型有關(guān)，禽流感目前為止則只與A型有關(guān)。A型流感病毒根據(jù)其表面糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶亞型（NA）的組合，進(jìn)一步分為多種亞型。目前已有18種HA亞型和11個NA亞型，其中大部分在野生鳥類中貯存[1]。主要有3種A型流感病毒亞型與人季節(jié)性流感有關(guān)，分別是H1N1、H2N2和H3N2型。而在B型流感病毒中，主要有兩個系譜（B/Victoria和B/Yamagata）與人季節(jié)性流感有關(guān)，2017年年末，季節(jié)性流感的特征是以B/Yamagata系譜為優(yōu)勢流行株[2]。這幾個亞型毒株每年感染5%～15%人類，導(dǎo)致全球約50萬人死亡[3]。盡管經(jīng)過數(shù)十年的監(jiān)測和藥物與非藥物的干預(yù)，季節(jié)性流感病毒每年仍然會在世界各地引起流行病。造成這些流行病反復(fù)發(fā)生的關(guān)鍵過程病毒逃避先前感染或疫苗接種引起的免疫的進(jìn)化[4]。流感病毒疫苗不得不定期更新，以跟上病毒進(jìn)化的速度。

1 概述

A型流感和B型流感基因組均有8個RNA片段，編碼至少12種病毒蛋白，包括編碼病毒RNA依賴性RNA聚合酶PB1，PB2和PA、核蛋白NP、基質(zhì)蛋白M1、病毒表面離子通道蛋白M2、與免疫逃避有關(guān)的NS1和介導(dǎo)病毒RNP核輸出的NEP蛋白、病毒表面糖蛋白HA和NA，以及編碼附件蛋白如誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的PB1-F2蛋白[5]、調(diào)節(jié)病毒致病性的PA-X蛋白[6]等。流感病毒通過HA與細(xì)胞表面唾液酸受體結(jié)合，負(fù)責(zé)粘附和膜融合。NA則通過切割宿主細(xì)胞和新生病毒表面的唾液酸，阻止病毒在宿主細(xì)胞表面積聚，促進(jìn)新生病毒粒子出芽釋放。由于核苷酸復(fù)制的高錯配率以及基因片段的不同組裝形式，流感病毒通過點突變的積累和基因片段重組進(jìn)行進(jìn)化，分別被稱為抗原漂移（antigenic shift）和抗原轉(zhuǎn)變（antigenic drift）。

HA蛋白是流感病毒免疫反應(yīng)的主要靶抗原，也是流感病毒疫苗的關(guān)鍵組分。在病毒粒子中，HA組成同源三聚體蛋白，每個單體含有球狀頭（HA1）和莖域（HA2）。HA抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)大多是針對球狀頭部的，但老年人體內(nèi)也會出現(xiàn)直接針對莖部抗體[7]。

精準(zhǔn)確定抗原漂移的分子決定簇一直是研究重點。自上世紀(jì)80年代以來，利用單克隆抗體和HA蛋白結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析，確定了5個廣譜的抗原簇，每個簇都由球狀頭部上多個氨基酸殘基（amino acid，aa）組成[8]。最近的一項研究表明，在A/H3N2病毒HA受體結(jié)合位點周圍，僅7個Aa（按H3病毒HA氨基酸殘基位置，在第145、155、156、158、159、189和193位）是1968～2003年間H3N2病毒抗原變異的主要位點。自2003以來的A/H3N2變異株都與這7個位點的變異相關(guān)[9]。

靶向HA莖部的抗體具有重要的生物學(xué)意義。因為在各亞型中HA莖部區(qū)域趨向于保守，所以針對莖部的抗體能夠提供亞型間的保護(hù)[10]。靶向莖部抗體的抗原逃逸尚未被廣泛報道。A/H3N2病毒只要通過單氨基酸Q387K替換，就可以在體外逃避莖部抗體[11]。

流感病毒NA抗體也能發(fā)揮一定免疫保護(hù)作用，該抗體可明顯抑制人體內(nèi)病毒復(fù)制。與HA相似的是，NA抗原分子決定簇也是比較集中的。NA抗原突變出現(xiàn)時間與HA抗原漂移也并非同步[12]。

2 病毒的進(jìn)化限制因素

如上所述，負(fù)責(zé)A/H3N2病毒HA中的7個aa及其附近抗原位點的突變成為免疫逃逸關(guān)鍵限制因素。為了逃避針對HA的中和抗體，這些位置的突變必需引起抗原改變，而不擾亂受體結(jié)合功能，這是一個非常微妙的平衡關(guān)系。

唾液酸受體結(jié)合親和力是限制抗原進(jìn)化速率的重要影響因素之一[13]。在HA受體結(jié)合位點周圍的抗原突變?nèi)菀灼茐牟《九c受體的結(jié)合力。與唾液酸受體結(jié)合親和力較高的病毒相比，唾液酸受體結(jié)合親和力較低的流感病毒不易發(fā)生受體結(jié)合位點附近的氨基酸替換。這種受體結(jié)合平衡可以有效地限制抗原漂變。這解釋了連續(xù)傳播的流感病毒的抗原準(zhǔn)種相對均勻性[14]。

基因鏈上基因出現(xiàn)氨基酸替換是進(jìn)化限制的決定性因素之一。流感病毒的流行病學(xué)和進(jìn)化動力學(xué)模型理論研究顯示：為了獲得那些改變病毒抗原性而對適應(yīng)性沒有影響的病毒蛋白質(zhì)，該病毒需要獲得多個基因的突變，抗原突變頻率才可能受到限制[15]。另一種理論模型研究提出：對病毒適應(yīng)性有害的突變體更會限制HA抗原漂變[16]。

除此之外，急性流感感染突變病毒出現(xiàn)概率亦受到先天性免疫的限制，使得引起宿主體內(nèi)免疫逃避的抗原突變體并不常見。A型流感病毒RNA聚合酶每輪復(fù)制每個位點突變率約在2×10-6～2×10-4，所以每輪復(fù)制中，通過改變單核苷酸產(chǎn)生特定抗原突變數(shù)大致為2×105。因此，在一個感染的單細(xì)胞中，即可產(chǎn)生約104個準(zhǔn)種病毒[17]，然而，即便突變體出現(xiàn)在第一輪復(fù)制中，在抗體產(chǎn)生之前，大量子代病毒在黏液纖毛層中就被清除。這類先天性免疫屏障系統(tǒng)很可能會大大減少新生成準(zhǔn)種的種類數(shù)量，只有少數(shù)突變型病毒成功感染其他細(xì)胞[18]。

3 免疫選擇壓力

曾經(jīng)研究者一直認(rèn)為，流感病毒進(jìn)化似乎來自之前感染或疫苗接種引起的免疫選擇壓力。然而，迄今為止，該現(xiàn)象的分子機(jī)制仍未找到明顯的證據(jù)。事實上，最近一個研究通過測試166份個體樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：由疫苗和之前感染造成的新抗原突變準(zhǔn)種的出現(xiàn)率很低[19]。那么，宿主內(nèi)免疫選擇是如何影響病毒抗原進(jìn)化的？

先天性免疫選擇初次接觸流感病毒后，機(jī)體粘膜屏障形成富含唾液酸的黏液層，通過唾液酸與HA蛋白結(jié)合而發(fā)揮誘餌作用，從而捕獲大量病毒，有效地降低了感染數(shù)量。當(dāng)流感病毒感染宿主細(xì)胞之后，Toll樣受體（TLRs）和干擾素通路被迅速激活，大量產(chǎn)生細(xì)胞因子建立抗病毒狀態(tài)，抑制周圍細(xì)胞內(nèi)流感病毒的復(fù)制[20]。總的來說，先天性免疫反應(yīng)限制病毒進(jìn)化是通過減少允許病毒繁殖的細(xì)胞可利用性和通過減少病毒多樣性來限制流感病毒的進(jìn)化，而并非依賴于抗原表型的變異[21]。

適應(yīng)性免疫選擇流感病毒反復(fù)感染和重復(fù)被動免疫，使得來自抗體和記憶免疫細(xì)胞的選擇壓力變得相當(dāng)復(fù)雜。對于機(jī)體而言，免疫選擇的強(qiáng)度取決于暴露于病毒或者疫苗抗原的頻率，相似的抗原及衰減的免疫力均會導(dǎo)致免疫選擇降低[22]。

在初次接觸抗原的個體中，逃避先天免疫選擇的病毒得以繼續(xù)復(fù)制，并在感染后24～72 h后，達(dá)到高峰期，然而產(chǎn)生特異性抗體則需要7～8 d[23]，這導(dǎo)致首次感染時宿主體內(nèi)對病毒幾乎沒有抗原選擇性。急性流感病毒感染導(dǎo)致抗原瞬時暴露于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中，然而，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)建立一個高度特異性免疫壓力的必要條件卻需要病毒能長期存在[24]。

上呼吸道黏膜免疫主要由IgA介導(dǎo)。為結(jié)合并中和流感病毒，IgA能夠穿越血管上皮屏細(xì)胞到達(dá)上呼吸道管腔[25]。這一免疫反應(yīng)會選擇存在于感染過程的任何新突變株，是流感病毒進(jìn)化的選擇壓力來源的關(guān)鍵因素之一。

二次感染由于存在抗原交叉性，大多會喚醒免疫記憶，然而，免疫記憶產(chǎn)生的抗體結(jié)合新抗原變體表面HA頭部，不利于宿主免疫系統(tǒng)對新抗原突變體有效產(chǎn)生抗體應(yīng)答[26]。

4 傳播限制

新的抗原變異株可能會在傳播給下一個宿主的過程中失去活性，除非能夠在被感染的個體中復(fù)制到高水平。病毒種群的傳播瓶頸主要發(fā)生在供體宿主排出病毒，進(jìn)入受體宿主，尤其是穿越先天性免疫屏障的過程中。每一個瓶頸都可能很嚴(yán)重地導(dǎo)致新產(chǎn)生的病毒多樣性受到重大損失。這些瓶頸隨傳播途徑不同而變化，呼吸飛沫傳播能力比直接接觸傳播具有更大的瓶頸[27]。

與宿主體內(nèi)和個體間傳播過程相似，較大規(guī)模的病原生態(tài)學(xué)對流感病毒的傳播和進(jìn)化影響很大，比如流感病毒流行的季節(jié)性、短暫性及病毒巨大多樣性等因素。即使變異株較流行株產(chǎn)生良好適應(yīng)性進(jìn)化，但新的變異株也幾乎沒有時間與現(xiàn)有的流行株產(chǎn)生競爭，無法復(fù)制到高水平，亦沒有機(jī)會孕育成流行株。

季節(jié)性流感病毒流行的時間在全球各不相同，在溫帶地區(qū)，大多數(shù)流感病毒感染發(fā)生冬季,在熱帶地區(qū)，則大多發(fā)生雨季[28]。動物攻毒模型結(jié)果證明：季節(jié)性流感病毒的呼吸道飛沫傳播方式，在低溫和低濕度的環(huán)境下，比在高溫和高濕度的環(huán)境下，傳播更有效[29]。這可以解釋流感病毒流行區(qū)主要集中在南北半球的溫帶地區(qū)。然而，在熱帶地區(qū)，流感病毒的流行與雨季相吻合，在這期間溫度和相對濕度都很高。這意味著，在熱帶地區(qū)，流感病毒通過直接接觸或污染物傳播比通過呼吸飛沫傳播更為重要。因此，在熱帶地區(qū)與接觸傳播有關(guān)的更多瓶頸反而可促進(jìn)流感病毒進(jìn)化。

5 流感控制策略

疫苗是防控季節(jié)性流感的主要手段之一。疫苗接種在病毒進(jìn)化中的影響比流感病毒感染在病毒進(jìn)化中的影響要小，因為只有小于10%的世界人口是常規(guī)接種流感病毒疫苗的[30]。但是，疫苗的免疫效果卻有著巨大的影響。因此，流感病毒疫苗的配方每年都要再評估兩次，以確保疫苗種毒和未來可能造成流行的病毒相匹配。為了適應(yīng)生產(chǎn)、運(yùn)輸和管理的疫苗所需要的時間，耗時長的疫苗生產(chǎn)過程主要是使用雞胚生產(chǎn)技術(shù)，這期間為新的病毒突變體創(chuàng)造了一個窗口期，常導(dǎo)致疫苗免疫效力脫節(jié)。在人類適應(yīng)性毒株在雞胚中有效復(fù)制過程中，雞胚生產(chǎn)疫苗技術(shù)也可能導(dǎo)致意外的疫苗毒株的抗原變異[31]。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以更快地生產(chǎn)疫苗，為更有效的疫苗帶來曙光。此外，相對于雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，反向遺傳學(xué)重組技術(shù)的大幅減少了疫苗種毒制備時間，一旦病毒基因組被測序出來，生產(chǎn)就可以開始了，而不是從活病毒篩選開始。如果大多數(shù)流感病毒疫苗是用重組技術(shù)生產(chǎn)的，疫苗株的快速確定可以更接近預(yù)期使用疫苗的時間，從而減少了人群中出現(xiàn)新變異株的窗口期。

除了及時更新流感疫苗以適應(yīng)新型流感病毒以外，能迅速檢測出新型流感病毒的檢測方法對控制流感也非常重要。新型流感病毒的鑒定需要得到它的8個片段基因序列，通過序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析確定病毒亞型。此方法首先要獲得序列，可以通過找到保守 PCR 通用引物，然后consensus PCR擴(kuò)增獲得其序列。然后直接測序獲得基因序列[32]。該方法要求樣品病毒滴度較高，而且實驗周期較長。近年發(fā)展起來的高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）能夠更簡單更全面檢測病毒全基因組序列，該方法不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，直接對臨床標(biāo)本中的核酸池（pool）進(jìn)行測序，但其檢測特異性較低，因為建庫過程中宿主基因組和環(huán)境微生物基因組不能完全去除。因此，高通量測序技術(shù)較適用于無法體外培養(yǎng)分離的病毒、高度變異病毒、重組病毒以及新病毒的鑒定和研究。

隨著流感的變異，已有的抗流感藥物面臨嚴(yán)峻的耐藥形勢，抗流感藥物也需要根據(jù)流感的進(jìn)化不斷研發(fā)更新。由于季節(jié)性流感中已出現(xiàn)廣泛的M2離子通道耐藥位點，目前WHO已不推薦烷胺類藥物用于季節(jié)性流感的臨床治療。有廣譜抗病毒活性的法匹拉韋，阻斷翻譯后階段病毒血凝素成熟的硝唑尼特，PB2帽子結(jié)合區(qū)的抑制劑VX787等抗流感小分子藥物陸續(xù)上市，有望在緩解流感進(jìn)化導(dǎo)致的一線藥物的耐藥威脅[33]。

6 展望

雖然每年流感流行株呈現(xiàn)多樣性，但病毒進(jìn)化的選擇壓力發(fā)揮作用的機(jī)會卻很少。機(jī)會減少的限制因素有：病毒生物學(xué)固有的（由于病毒可適應(yīng)的突變數(shù)目有限）、免疫學(xué)固有的（先天性免疫、適應(yīng)性免疫壓力等）或流行傳播固有的（因為流行傳播和季節(jié)性的限制）。

三代測序的強(qiáng)大功能對研究流感病毒的進(jìn)化非常有利。越來越精細(xì)的計算和數(shù)學(xué)建模整合了病毒和宿主間互作的不同數(shù)據(jù)源，特別是抗原變異數(shù)據(jù)，將對季節(jié)性流感病毒演變規(guī)律發(fā)揮重要的作用。另外，免疫譜序列可用于分析感染和接種期間的免疫應(yīng)答反應(yīng)，可以識別個體之間共享的宿主免疫應(yīng)答標(biāo)識，從而為影響病毒進(jìn)化的宿主內(nèi)和群體水平的選擇性壓力的系統(tǒng)特征提供有效的手段[34]。在疫苗設(shè)計階段，這些精準(zhǔn)的免疫標(biāo)記可用于預(yù)測疫苗的免疫效力[35]。在未來，有理由相信，使用這些新興技術(shù)解析病毒基因型的變化如何影響特異性免疫表型，用于流感病毒疫苗的新概念設(shè)計中，將會更好地控制流感大流行。