于永昂， 張 蕾， 趙俊杰， 賀 杰， 馬振鋒， 胡海燕

(河南科技學院生命科技學院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

植物在自然界中經(jīng)常會受到病菌、干旱、冷害和高鹽等生物和非生物脅迫，引發(fā)細胞內(nèi)部產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，大量積累的ROS能夠?qū)χ参矬w內(nèi)的核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生傷害[1]。為了保持細胞內(nèi)部氧化還原的平衡，植物在長期進化過程中發(fā)展出幾種酶和非酶系統(tǒng)來緩解由活性氧引起的氧化損傷，其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是植物用來清除活性氧的一種關(guān)鍵酶。SOD能夠催化植物體內(nèi)分子氧活化的中間產(chǎn)物超氧陰離子自由基(O2-·)的歧化反應從而生成氧分子和過氧化氫，在逆境脅迫下增強SOD基因表達能夠提高植物清除活性氧的能力，增強植物的抗逆性[2]。超氧化物歧化酶按照金屬輔基主要分為鐵(Fe)SOD、(錳)SOD和(銅/鋅)SOD 3種。許多研究表明，MnSOD與作物的抗逆性有著密切的關(guān)系。Tanaka等利用酵母MnSOD在水稻中過量表達提高了轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫的耐受性，轉(zhuǎn)基因植株的SOD和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性在鹽脅迫處理條件下能夠提高1.5～2.0倍[3]；韓利芳等將煙草MnSOD基因轉(zhuǎn)入苜蓿中提高了轉(zhuǎn)基因植株的MnSOD活性[4]；王丙鋒等將檉柳MnSOD基因轉(zhuǎn)化到酵母基因組中，提高了酵母的抗旱和耐高溫的能力[5]；陳莉等在仙客來中過表達MnSOD基因，提高了轉(zhuǎn)基因植物對高溫脅迫的抗性[6]。

小麥是我國重要的糧食作物之一，但干旱、低溫和鹽堿等非生物脅迫嚴重影響其產(chǎn)量[7]。為此，本研究從小麥葉片中克隆MnSOD基因全長序列，并對該基因蛋白在生物信息學分析的基礎(chǔ)上構(gòu)建了pET32-TaMnSOD原核表達載體，在大腸桿菌中用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)成功誘導表達出目的蛋白，為小麥MnSOD蛋白的進一步分離純化和基因的表達、提高小麥對逆境脅迫的適應能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 本試驗小麥品種為矮抗58，由河南科技學院小麥中心提供。2016年5月選取顆粒飽滿、大小一致的種子用0.1% HgCl2消毒10 min后，用流水沖洗5次后置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，3 d后選取發(fā)芽的小麥種子播種至含有混合營養(yǎng)基質(zhì)的營養(yǎng)缽內(nèi)，在16 h光照(28 ℃)—8 h黑暗(25 ℃)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3葉期時，取新鮮嫩葉用液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株與試劑 原核表達載體pET-32a、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α及表達菌株BL21(DE3)均由河南科技學院生命科技學院分子生物學實驗室保存。pGM-T載體、DNA凝膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶及質(zhì)粒小量抽提試劑盒均購自TIANGEN公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 小麥葉片總RNA的提取和cDNA的合成 參照Trizol試劑盒說明書提取小麥葉片的總RNA。調(diào)整提取的RNA濃度為200 ng/μL，用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa，大連)按操作說明合成cDNA第1鏈。

1.2.2 小麥MnSOD基因的克隆 根據(jù)GenBank公布的小麥MnSOD基因序列(GenBank登錄號：AF092524)設(shè)計特異性引物MnSOD-F1(5′-CCATGGCGCTCCGCACGTT-3′)和MnSOD-R1(5′-GTGTCACCTCTATGCAATGT-3′)。以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化PCR產(chǎn)物。將回收的目的片段與pGM-T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行PCR鑒定后送北京三博遠志生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.3 小麥MnSOD基因的生物信息學分析 用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析小麥MnSOD編碼氨基酸序列的物理性質(zhì)；用Predict protein預測MnSOD基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)；用SMATER分析MnSOD基因編碼蛋白的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；利用BlastP(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行同源性搜索，選取與小麥MnSOD同源性較高的植物的MnSOD氨基酸序列，利用DNAMAN 8.0進行多序列比對，用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)獲得的小麥MnSOD編碼區(qū)序列設(shè)計原核表達引物MnSOD-F2(5′-CGGGATCCATGGCGCTCCGCACGTTG-3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點)和MnSOD-R2(5′-CCCAAGCTTCGCAAGCACTTTTTC ATA-3′，下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點)，以小麥葉片cDNA為模板進行PCR擴增。用T4連接酶將回收純化的PCR產(chǎn)物與pGM-T載體于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取單克隆進行測序分析。將測序正確的pGM-TaMnSOD質(zhì)粒與原核表達載體pET-32a分別用BamHⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切操作，回收目的片段，經(jīng)T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，抽提質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，獲得原核表達載體pET32a-TaMnSOD。

1.2.5 重組質(zhì)粒融合蛋白的表達 將測序正確的pET32a-TaMnSOD重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上。挑取陽性克隆于含有卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。按1%的接種量接種到10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.5左右，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導3 h。5 000 r/min離心5 min收集菌體，加入SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)上樣緩沖液煮沸10 min，取10 μL進行SDS-PAGE(5%濃縮膠，12%分離膠)，分析蛋白表達結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥MnSOD基因的克隆

以小麥葉片cDNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在分子量相當于750 bp左右擴增出1條清晰的條帶(圖1)，與預測大小相符，推斷其為小麥MnSOD基因序列。測序結(jié)果表明，該基因全長813 bp。采用NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)的ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含1個675 bp的開放閱讀框，編碼224個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA(圖2)。

2.2 小麥MnSOD基因的生物信息學分析

用ProtParam預測TaMnSOD基因編碼蛋白的相對分子量為24.56 ku，分子式為C1 119H1 724N300O318S3，等電點(pI)為6.83。理論推導其半衰期約為30 h，不穩(wěn)定參數(shù)為29.56，蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定(不穩(wěn)定參數(shù)在40以下為穩(wěn)定蛋白)?？偟膸ж撾姾傻臍埢?Asp+Glu，即天冬氨酸+谷氨酸)為24個，總的帶正電荷的殘基(Arg+Lys，即精氨酸+賴氨酸)為23個。親水性平均數(shù)為-0.269，預測該蛋白為親水性蛋白，其脂肪指數(shù)為91.52。用TMHMM-2.0(http：//www. cbs. dtu. dk / services / TMHMM-2.0)對TaMnSOD的氨基酸序列進行分析，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，沒有信號肽，是一個可溶性蛋白質(zhì)。MnSOD蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，在整個蛋白中，α-螺旋占35.71%，β-折疊占15.18%，無規(guī)則卷曲占27.23%，延伸鏈占 21.88%。將推測的TaMnSOD氨基酸序列在GenBank上進行Blast比對后，采用DNAMAN 6.0軟件進行多重序列比對。將克隆的TaMnSOD基因編碼的氨基酸序列與GenBank中其他植物的MnSOD氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白與大麥(BAK03227)、二穗短柄草(XP_010231530)、水稻(XP_015640127)的MnSOD具有較高的同源性，氨基酸相似性分別達到95.13%、88.70%、82.68%(圖3)。進一步經(jīng)Clustal W聚類分析后，利用Mega 5.0軟件采用相鄰連接法繪制進化樹，結(jié)果表明，本研究克隆的小麥TaMnSOD基因編碼的蛋白和大麥的親緣關(guān)系最近(圖4)。

2.3 原核表達載體的構(gòu)建與鑒定

使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切質(zhì)粒pET32-TaMnSOD，切出來的片段與預期結(jié)果大小一致，表明TaMnSOD基因已經(jīng)插入載體pET-32a中(圖5)。酶切鑒定正確的陽性克隆，經(jīng)測序后顯示插入的外源基因序列與預期片段序列一致，未出現(xiàn)堿基突變及移碼現(xiàn)象。由此表明，pET32-TaMnSOD原核表達載體構(gòu)建成功。

2.4 MnSOD基因重組蛋白的SDS-PAGE分析

將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒pET32-TaMnSOD轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在37℃、IPTG濃度為0.5 mmol/L 條件下，分別誘導1、2、3、4 h后進行SDS-PAGE分析。圖6結(jié)果表明，與對照相比，pET32-TaMnSOD轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導后，在相對分子質(zhì)量為45 ku左右處有1條蛋白條帶，除去載體PET32自身表達的20 ku蛋白后，結(jié)果與預期的目的蛋白(24.56 ku)大小一致。

3 討論

植物在不利環(huán)境脅迫(鹽漬、干旱、高溫、低溫等)下其細胞代謝過程不協(xié)調(diào)會引起ROS大量積累，構(gòu)成氧化脅迫威脅植物的細胞結(jié)構(gòu)[8-9]。因此，采用分子生物學手段，對植物的氧化代謝進行修飾，提高植物抗氧化脅迫的能力，是植物抗性研究的方向之一[10-11]。SOD是植物細胞防御系統(tǒng)中重要的保護酶類，在防御活性氧傷害中起著關(guān)鍵性的作用，其活性高低與植物的抗逆能力密切相關(guān)[12]。目前，植物中許多MnSOD基因已經(jīng)被克隆并用來轉(zhuǎn)化不同植物，獲得了SOD活性增強的轉(zhuǎn)基因植株。鄧婷婷等將極端耐鹽的鹽生杜氏藻的DsMnSOD基因轉(zhuǎn)化SOD缺陷型大腸桿菌并誘導其表達，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的大腸桿菌在耐鹽和抗寒等方面的耐受性明顯提高[13]。付暢等將西伯利亞蓼PsMnSOD基因轉(zhuǎn)入酵母中，提高了酵母在鹽堿脅迫下的SOD活性，并提高了酵母對鹽堿脅迫的抗性，表明PsMnSOD基因在抵御鹽堿脅迫中起到非常重要的作用[14]。另外，MnSOD在轉(zhuǎn)基因煙草、苜蓿和棉花等植物中的過量表達提高了它們對氧化脅迫的耐受性[10]。由此表明，MnSOD基因?qū)τ谠鰪娭参锏目鼓婺芰哂兄匾饔谩?/p>

目前，用于表達重組蛋白的外源系統(tǒng)主要有大腸桿菌系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)和動物細胞表達系統(tǒng)[15-17]。大腸桿菌表達系統(tǒng)因其具有遺傳背景清楚、結(jié)構(gòu)簡單、外源蛋白表達量高以及基因表達調(diào)控機制明確等優(yōu)點，已經(jīng)成為目前最常用的表達宿主[18]。真核生物基因的原核表達受表達載體、宿主菌、IPTG濃度、溫度、誘導表達時間等因素的影響[19-20]。本試驗采用目前應用最廣泛的pET大腸桿菌表達系統(tǒng)進行原核表達，該系統(tǒng)能與Tag(標簽)連接進行融合蛋白表達，目的蛋白易于純化，并且具有操作方便、表達量大等優(yōu)點[21]。一般 37 ℃、0.5 mmol/L 終濃度的IPTG適合絕大多數(shù)的蛋白表達，本研究采用該條件進行原核表達，所表達出的融合蛋白與目的蛋白相對分子量一致。

本研究從小麥葉片中克隆到Mn超氧化物歧化酶基因TaMnSOD，其編碼蛋白與其他植物中的MnSOD具有較高的相似性。將TaMnSOD基因與原核表達載體PET-32a構(gòu)建融合表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達，從而為小麥MnSOD基因編碼蛋白功能研究提供理論基礎(chǔ)。